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基本类型:

    酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

用途:

    根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA（Dot-ELISA）;再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

操作程序:

1、间接ELISA

    本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下：

(1) 材料

① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；

② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；

③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

(2) 方法步骤

① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液

⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

2、双抗体夹心ELISA

    本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。

① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液

⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

3、双夹心ELISA

    此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。

此法的基本程序为：

① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。

4、竞争ELISA

    此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。

其基本程序为：

① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

④ 用ELISA检测仪测定OD值。

   被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。

5、阻断ELISA

本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。

下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：

① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。

   本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

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