流动相： a、溶剂必须是HPLC级的，试剂则尽可能使用高纯度的； b、不与固定相发生化学反应，粘度小，且对样品有适宜的溶解度，要求 k 在1～10范围内（可用范围）或2～5（*范围），k 值太小，不利于分离；k 值太大，可能使样品在流动相中沉淀； c 、 流动相使用之前必须过滤和脱气； d、确保溶剂间是相互混溶的； e、流动相必须与检测器相匹配，如用紫外检测器时，不能选用截止波长大于检测波长的溶剂。 痕量的杂质会极大地降低色谱柱的性能，当需要更换流动相时，确保溶剂（缓冲液）之间是相互混溶的。若使用的溶剂与色谱柱中的溶剂不能混溶，则需使用过渡溶剂，否则会对色谱柱产生*性的伤害。盐或缓冲液从流动相中析出也会对色谱柱产生*性的伤害。每次进样前应该检查样品在流动相中的溶解性，如果可能尽量使用流动相溶解样品。 ②、固定相： a、流动相的pH值应保持在2.0－8.0之间（除非有特殊说明）； b、如果有必要可使用预饱和柱和保护柱； c、使用氨基柱时，流动相和样品中尽量避免含醛类和酮类物质。 当前的反相色谱柱填料可分为以下三种： ⒈硅胶柱：柱效高，机械强度大，但对pH敏感，低pH值（<2.0）会使键合相水解（除去键合的功能集团）；高pH值（>8.0），硅胶溶解。如果流动相的pH值接近2.0或8.0，需要使用预饱和柱。 ⒉有机聚合物填料：在宽pH范围内稳定，残留硅羟基效应较小；但其柱效低，机械强度不高，在不同的溶剂中可能缩水或溶胀。在应用过程中，压力不能超过其zui大能承受的限制，且流动相中有机溶剂如甲醇、异丙醇、乙醇的含量不能超过10％。 ⒊有机－无机杂化粒填料：新开发的一种新型填料，由两种高纯的单体（有机聚合物和无机硅烷）合成的高纯度填料，此类填料将硅胶填料和有机聚合物填料的优点有机地结合起来，柱效高、机械强度高、稳定性好、pH范围宽，特别是表面和颗粒内部的硅羟基大部分被有效的屏蔽，使其对碱性物质的保留性能非常好。 ③、背压（backpressure）和流速： a、保持背压低于3500psi（245bar）； b、避免任何突然的压力变化； c、如果背压高（>3500psi），可反冲色谱柱，但流速应为正常流速的1/5-1/2； d、如果检测池需要除气，可以使用背压调控器（backpressure regulator）。 为zui大限度的延长色谱柱的寿命，可根据色谱柱的填料的粒径、色谱柱的内径对流速进行调整，使得背压<3500psi。如果背压不超过界限，色谱柱的流速可任意设定