蛋白纯化常见问题（一）
时间：2023-04-29 阅读：45
Q：如何去除样品中的 DNA/RNA 等核酸杂质污染？
A：延长超声时间以降低粘度。也可以使用核酸酶如 Benzonase 同时消化 DNA 和 RNA。如果来源是大肠杆菌裂解液，含有大量的DNA，可以用沉淀等方法，预先去除大量的 DNA。
通过层析方法去除 ：由于核酸带负电，在阴离子柱上会结合或阳离子柱上流穿，也可以有效去除核酸。
去除填料上结合的核酸 ：一般采用 1M NaOH + 1M NaCl 对核酸的去除效果较好。如果核酸的吸附过强，会采用强烈的方法，3M NaCl可去除靠静电吸附的核酸，然后用 1M NaOH分解核酸，之后再用 3M NaCl 清洗。
Q：柱子有色素如何去除？
A：
色素性质较复杂，可以根据填料的耐受情况，尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂（如 30% 异丙醇或乙醇）或酸（如 0.01 M HCl）处理，*好将填料拆出，分别浸泡在不同试剂中。
也可以考虑使用混合试剂进行处理，例如：通过混合8M尿素 + 0.5 M 乙酸 + 2 M NaCl，对于和阴离子交换等介质紧密结合的化合物，通常很有效；或者1 M NaOH混合1-2 M 盐；可以耐受有机溶剂的情况下，尝试1 M NaOH混合20-30%的异丙醇；根据色素的不同性质，也可以尝试不同的去污剂，注意避免操作中产生气泡。
如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除，或验证是否对于样品纯化造成影响。
Q：柱子堵了、超压如何处理？
A：可能原因 ：缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞 ；流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。
建议处理方法 ：首先将柱子卸下来，确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了 ：参考说明书 CIP 操作进行清洁 ；更换层析柱顶端滤膜或超声清洗 (Hitrap，HiPrep 与 Precision Columns 3.2/300 柱型均不能拆卸换膜 ) ；必要时移除层析柱顶端 2-3mm 凝胶，调节 Adaptor消除顶端死体积。部分预装柱，也可以将填料倒出，去除板结或碎填料后，重新装填。测定柱效或重复之前做过的样品。后续注意样品前处理（包括上柱子前的离心或过滤处理、优化利于样品稳定存在的缓冲液条件、核酸等粘稠杂质的去除等）以及层析柱的日常维护。
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