过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书
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1003次过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒说明书
测定意义:
微量法 100 管/96 样
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是zui主要的 H2O2 清除酶, 在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理:
H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能够分解 H2O2,使反应溶液 240nm 下的吸光度随反 应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、 研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 125μL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置 冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 240nm,蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配制:用时在试剂二中加入 25mL 试剂一,充分混匀,作为工作液。
3、测定前将 CAT 检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,立即混匀并计时,记录
240nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A1-A2。
CAT 活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=459×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=459×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.917×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:H2O2 摩尔消光系数,4.36×104 L / mol /cm;d:比 色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反 应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数, 500 万。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)CAT 活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=918×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=918×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.836×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:H2O2 摩尔消光系数,4.36×104 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总 数,500 万。