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过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书

时间:2015-10-29      阅读:1001

过氧化酶(CatalaseCAT试剂盒说明书

测定意义:

微量法 100 /96 

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是zui主要的 H2O2 清除酶, 在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理:

H2O2  240nm 下有特征吸收峰,CAT 能够分解 H2O2,使反应 240nm 下的吸光度反 应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光度计/酶标、台式心机、调式移液器、微量石比色皿/96 UV 、 研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 125μL×1 瓶,4℃保存。 

粗酶液提取: 

1、细菌、细胞或组织样品的制备

收集细菌细胞到心管离心弃上 500 万细菌细胞 1mL 提取液, 超声波破细菌或(,功率 20%或 200W 3s,间隔 10s,重复 30 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置 冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 240nm,蒸馏水调零。

2CAT 检测工作液的配制:时在试二中加入 25mL 试剂一,充分混匀,作为作液。

3、测定前将 CAT 检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,立即混匀并计时,记录

240nm 下初始吸光值 A1  1min 后的吸光值 A2计算 ΔAA1-A2

CAT 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(CAT 活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷V ÷T=459×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 样总)÷T=459×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算:

 

单位的定义:每 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/104 cell)[ΔA×V 反总÷ε×d×109500×V ÷V 样总)÷T =0.917×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 LεH2O2 摩尔消光系数,4.36×104 L / mol /cmd:比 色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT:反 应时间,1 minW:样本质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL500:细胞或细菌总数, 500 万。

b. 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清(CAT 活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷V ÷T=918×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109 V ÷V 样总)÷T=918×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109500×V ÷V 样总)÷T=1.836×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 LεH2O2 摩尔消光系数,4.36×104 L / mol /cmd96 孔板光径,0.5cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT 反应时间,1 minW:样本质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL500:细胞或细菌总 数,500 万。

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