过氧化氢酶(CAT)试剂盒的检测原理以及自备仪器
时间:2015-07-01 阅读:1971
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过氧化氢酶(CAT)试剂盒测定原理H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能够分解 H2O2,使反应溶液 240nm 下的吸光度随反 应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。
需自备的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、 研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 125μL×1 瓶,4℃保存。
1、细菌、细胞或组织样品的制备
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置 冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 240nm,蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配制:用时在试剂二中加入 25mL 试剂一,充分混匀,作为工作液。
3、测定前将 CAT 检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。
4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,立即混匀并计时,记录
240nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。计算 ΔA=A1-A2。