反相液相色谱法测定婴儿乳粉中*脂类含量
时间：2010-08-30 阅读：1581
作者：颜景超1，汤水平2，彭灿 1,2，任国谱1,*
摘 要：目的：开发一种快速测定婴儿配方乳粉中* 酯类含量的反相液相色谱法。方法：直接使用
二氯甲烷和甲醇体积比为2.5:1 的混合溶剂对样品进行提取，在30℃的条件下采用等度洗脱，流动相采用体积比为
80:20 的甲醇- 三氯甲烷溶剂，流动相流速1.0mL/min；色谱柱温度30℃，检测波长325nm。结果：*醋
酸酯和* 棕榈酸酯的回收率分别为100.1% 和102.8%，多次测定结果的相对偏差分别为1.18% 和0.96%，检
出限分别为3.1ng 和4.3ng。结论：本方法操作简单、精密度、回收率和灵敏度高，适用于婴幼儿配方乳粉中的
* 酯类的检测。
关键词：* 酯类；婴儿配方乳粉；反相液相色谱
Rapid Determination of Retinyl Esters in Infant FormulaMilkPowder by Reversed-Phase
High-performance Liquid Chromatography
YAN Jing-chao1，TANG Shui-ping2，PENG Can1,2，REN Guo-pu1,*
（1. College of Food Science and Engineering, CentralSouthUniversity of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；
2. Hunan Avadairy Co. Ltd., Changsha 410200, China）
Abstract ：Objective: To develop a rapid reversed-phasehighperformance liquid chromatographic （RP-HPLC） method for
measuring retinyl esters in infant formula milk powder.Methods:Samples were directly extracted with a mixture ofdichloromethane
and methanol （2.5:1, V/V）. The chromatographic separationwasperformed at 30 ℃ in the isocratic elution mode using a
phase composed of a mixture of methanol and chloroform（80:20,V/V）. Results: Retinyl acetate and retinyl palmitatepresented
average spike recoveries of 6 replicates at 2 levels of100.1%ａnd 102.8%, with relative standard deviations of 1.18% ａnd0.96%,
respectively. The detection limits for retinyl acetateａndretinyl palmitate were 3.1 ng and 4.3 ng, respectively.Conclusion:The
method demonstrates simplicity and high precision, recoveryａndsensitivity, and thus has promising potential for practical
applications.
Key words：retinyl esters；infant formulamilkpowder；reversed-phase high performance liquid chromatography
中图分类号：TS252.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630（2010）08-0154-04
VA 是一种重要的*，其主要生理功能
是维持视觉和骨骼健康、参与细胞分裂和细胞识别、参与生长、生殖及维持免疫系统的完整性等[1]。GB10766—1997《婴儿配方乳粉Ⅱ、Ⅲ》和GB 10765 — 1997
《婴儿配方乳粉Ⅰ》中规定婴儿配方乳粉中VA 的含量
为1250～2500IU/100g，其允许添加使用的种类中包括* 醋酸酯和* 棕榈酸酯[2]。目前测定婴儿配
方乳粉中的VA多采用液相色谱法[3-9]，分析之前一般需对样品进行皂化处理[3-7]，其过程溶剂消耗量大、操作繁琐且不能测出*酯类的含量。本实验采用反相色谱法定婴儿配方乳粉中*酯类，前处理不经皂化，直接使用二氯甲烷和甲醇混合剂沉淀蛋白并提取*酯类，能快速检出* 醋酸酯和*棕榈酸酯的含量，为生产过程中的维生素的控制和风
※分析检测食品科学2010, Vol. 31, No. 08 155
险评估体系的建立提供理论依据和实践指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
婴儿配方乳粉1 段（0～6 月婴儿食用） 市售。甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷（均为色谱纯） 美国edia公司；NaCl（分析纯）南京化学试剂有限公司；* 醋酸酯、* 棕榈酸酯标准品 美国Sigma 公司。
Waters alliance 2695 液相色谱系统（配有1200型，安捷伦公司紫外检测器，Empower控制软件）；UV-1800 紫外- 分光光度计日本岛津公司；BF2000 型氮吹仪；800B低速台
式离心机 上海安亭科学仪器厂；TC-C18 柱（4.6mm ×25cm，5μm） 美国安捷伦公司。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配制
* 醋酸酯和* 棕榈酸酯标准贮备液：分别准确称取10mg 的*醋酸酯或*棕榈酸酯，用甲醇定容于100mL 容量瓶中，制备成质量浓度为100μg/mL 的标准贮备液。*醋酸酯和*棕榈酸酯标准工作液：分别取1mL * 醋酸酯或*棕榈酸酯标准贮备液于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，制备成质量浓度为2μg/mL 的标准工作液。
1.2.2 样品前处理
准确称取0.25g 样品于10mL 离心管中，加入1mL 温水充分溶解，加入7mL体积比为2.5:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂对样品进行提取，旋涡振荡5min，静止5min后，加入1mL 饱和NaCl溶液，反转振荡3次，2500r/min 离心5min。将二氯甲烷层在氮气下吹干，用甲醇溶
解。通过0 . 2 2μm 的滤膜过滤，用棕色小瓶收集。
1.2.3 标准品的紫外光谱测定
将* 醋酸酯和* 棕榈酸酯的标准贮备液和标准工作液在波长200～400nm 内扫描，波长间隔1 nm。
1.2.4 色谱条件的正交试验设计
因素为流动相体积配比、柱温、流动相流速。本试验不考虑交互作用，采用L9（34）正交试验进行分析，有一个空列，可以作为实验误差以衡量试验的可靠性，因素水平见表1。
1.2.5 定量分析
采用外标法定量。
2 结果与分析
2.1 标准曲线及线性关系
分别配制质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL的标准溶液，进样测定，得到相应的峰面积。以标样质量浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线见图1。
因素
水平A 流动相体积配比B 色谱柱柱C 流动相流（甲醇:三氯甲烷） 温/℃ 速/（mL/min）
1 100:1 30 1.0
2 90:10 40 0.8
3 80:20 50 0.6
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels in orthogonal arraydesignforoptimizing instrumental parameters forHPLCanalysis结果表明，测得的标准曲线在标样质量浓度1～5μg/mL范围内线性关系良好，*醋酸酯和*棕榈酸酯标准曲线的回归方程分别为y ＝ 1 6 2 0 0 4 x －6012.6 和y=99332x －2628.1，相关系数R2分别为0.9992和0.9991。
2.2 *色谱条件的选择
2.2.1 *检测波长的选择
从图2 可以看出，*醋酸酯和*棕榈酸酯在此波长范围内均有两个特征吸收峰，依次分别为263、326nm和260、324nm，其中两种物质zui大吸收峰均在波长325nm左右，所以*测图1 * 醋酸酯和* 棕榈酸酯标准曲线
Fig.1 Standard curves of retinyl acetate and palmitate
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
y=162004x － 6012.6
R2=0.9992
峰面积/（mV·s）
标样质量浓度/（μg/mL）
0 1 2 3 4 5 6
y=99332x － 2628.1
R2=0.9991
* 醋酸酯* 棕榈酸酯
图2 * 醋酸酯和* 棕榈酸酯的紫外吸收光谱
Fig.2 UV absorption spectra of retinyl acetate and retinyl
palmitate standards
2.0
1.5
1.0
0.5
0
260nm
吸光度
波长/nm
200 250 300 350 400
－ 0.2
263nm
2
2
1
326nm
324nm * 醋酸酯
*棕桐酸酯
1
影响婴儿配方乳粉中* 酯类检测的主要色谱156 2010, Vol. 31, No.08食品科学※分析检测定波长为325nm。
2.2.2 色谱条件的影响
2.2.2.1 流动相配比的影响
实验中发现，使用甲醇作为流动相，*棕榈酸酯的保留时间都超过40min，不适合日常快速分析。采用甲醇与三氯甲烷不同的体积配比进行检测，当甲醇与三氯甲烷的体积比为80:20时，*酯类的分离度较好，保留时间也较短，15min内完成分析。三氯甲烷过多流动性极性过小，保留时间过短不适合作为反相流动相，因此依据液相分析经验在正交试验中选择甲醇与三氯甲烷的体积比范围为100:1、90:10、80:20。
2.2.2.2 流动相流速的影响
当流动相流速减少时，色谱峰的分离效果稍好，但是*酯类的保留时间延长，而且峰宽有所增加，峰高降低，*酯类检测的灵敏度降低。在液相测定过程中，流速一般设为1mL/min左右，流速过大会导致系统压力过大；流速过小，导致保留时间过长，且峰变宽，灵敏度降低，因此在正交试验中流动相流速水平选择1.0、0.8、0.6mL/min。
2.2.2.3 色谱柱温度的影响
通过30、40、50℃3个色谱柱温度试验，表明色谱柱温度对样品分离效果影响不大，只是对保留时间稍有影响；低温30℃比高温50℃时稍长，基本不影响峰高或峰面积，但是温度高流动相容易产生气泡。因此在正交试验选择色谱柱温度的范围为30～50℃。
2.2.3 色谱条件正交试验结果
图3 标准样和样品的色谱图
Fig.3 HPLC chromatograms of mixed retinyl acetate ａndretinylplamitate standards and a sample （both at a mixing ratio of1:1）
试验号
A 流动相体积配B 色谱柱空列C 流动相流
综合得分
比（甲醇:三氯甲烷） 柱温/℃ 速/（mL/min）
1 1（100:1） 1（50） 1 1（1） 67
2 1 2（40） 2 2（0.8） 65
3 1 3（30） 3 3（0.6） 61
4 2（90:10） 1 2 3 77
5 2 2 3 1 85
6 2 3 1 2 84
7 3（80:20） 1 3 2 92
8 3 2 1 3 87
9 3 3 2 1 95
k1 64.3 78.7 79.3 82.3 总分 713
k2 82 79 79 77
k3 91 80 77.7 75
R 26.7 1.3 1.6 7.3
表2 正交试验结果
Table 2 Arrangement of experimental results of orthogonal array
design for optimizing instrumental parameters for HPLC analysis
采用L9（34）正交试验，探讨流动相体积配比、流动相流速、色谱柱温度对*酯类测定的影响，从保留时间、峰型、系统压力3个方面通过综合评分来判断方法优劣。满分100 分，其中保留时间占50 分（3min计50分，53min 计0 分），峰型占40分（每种色谱条件基础分25，峰不前伸加3 分，不拖尾加3 分，然后按峰型好坏一次加9 到1分），系统压力10分（压力1000～1500psi 计10 分，1500～2000psi 计6 分，超过2000psi计2 分）。结果见表2 。
使用极差分析法分析数据，结果表明，流动相配比对* 酯类测定的影响zui大，其影响顺序是A 流动相体积配比＞ C 流动相流速＞B色谱柱温度。结合标准溶液的紫外吸收光谱结果，确定*色谱条件为：流动相体积配比为80:20的甲醇-三氯甲烷溶液，色谱柱温度30℃，流动相流速1.0mL/min，测定波长325nm。
根据以上确定的实验参数对* 酯类标准品和
样品进行分析，结果见图3 。
由图3 可以看出，* 酯类保留时间短，*醋酸酯大约为5min，*棕榈酸酯大约为10min，色谱峰附近不存在干扰物质，和其他成分分离效果良好。样品与标准峰形及出峰时间相吻合。
2.3 重复性实验
0.032
0.024
0.016
0.008
0
4.793
AU
时间/min
0 3 6 9 12 15 9.893
a.标准样（两种标准液按1:1 混合后进样）
0.0100
0.0075
0.0050
0.0025
0
4.668
AU
时间/min
0 3 6 9 12 15
9.893
b.样品（两种样品zui终提取液按1:1 混合后进样）
实验号
* 醋酸酯 * 棕榈酸酯
测定值/（IU/100g） 相对标准偏差/% 测定值/（IU/100g） 相对标准偏差/%
1 1942.43 1773.19
2 1937.19 1765.00
3 1987.82 1.18 1731.69 0.96
4 1963.38 1757.90
5 1931.95 1771.55
表3 重复性实验结果（n=5）
Table 3 Repeatability test for the method（n=5）※分析检测食品科学2010,Vol. 31, No. 08 157
按上述方法同一天内对市售婴儿配方1段乳粉样品进行5次重复测定，结果以*当量计。结果见表3。经统计分析表明，该法重复性好，*醋酸酯和*棕榈酸酯的相对标准偏差分别为1.18% 和0.96%。
2.4 加标回收率实验
在已知* 酯类含量的奶粉中加入标样，样品按上述方法处理后测定，结果以*当量计，结果
见表4 。
物质本底值/（IU/100g） 添加量/（IU/100g） 测定值/（IU/100g） 回收率/%平均回收率/%393299.5
2000 3794 96.0
*醋酸酯1952 3972 100.5 100.1
6012 101.0
4000 6190 104.0
5910 99.3
3835 102.0
2000 3733 99.3
*棕榈酸酯1760 3812 101.4 102.8
6100 105.9
4000 5979 103.8
6002 104.2
表4 回收率实验结果（n=6）
Table 4 Spike recovery test for the method （n=6）
选择两种添加水平，按上述方法进行测定。结果表明该法回收率高，6 次测定*醋酸酯和*棕榈酸酯的平均回收率分别为100.1% 和102.8%。
2.5 zui低检出限
按实验选定的色谱条件，以3 倍信噪比（RSN）计算出* 醋酸酯和*棕榈酸酯的zui低检出限分别为3.1ng和4.3ng。
3 结 论
通过正交试验确定了测定* 酯类的*色谱条件：流动相采用体积比为80:20的甲醇-三氯甲烷溶剂，流动相流速1.0mL/min，色谱柱温度30℃，检测波长325nm。加标回收率实验结果表明：加标平均回收率为100.1%和102.8%（n=6）。重复性实验结果表明相对偏差分别为1.18%和0.96%（n=5）。检出限分别为3.1ng 和4 . 3 ng。本法样品前处理简单，测定准确性和精密度高，适用于婴幼儿配方乳粉中* 酯类的定量分析，也适合于其他同类产品*酯类的测定。
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