由于具有高速度、高分离效果、高灵敏度等优点，近年来，HPLC的应用发展非常神速。目前，几乎所有需要分离的大分子有机物分析工作，它都可以发挥优势。可以预言，HPLC仪器的应用，将在“农、轻、重、海、陆、空，吃、穿、用”等各个领域、各行各业、无所不有。
但是，如何用好HPLC是一个非常关键的问题。基于作者的长期实践，以下从仪器学理论、分析误差理论、分析化学等多个角度来全面讨论。

1、泵、柱、检测器三者的关系的认识和目前使用者普遍存在的问题

　　目前很多研发、使用HPLC的科技工作者，没有搞清楚或没有搞清楚HPLC中的泵、柱、检测器三者的关系。国内外很多生产厂商只是生产泵、检测器，色谱柱子都是外购件。我们说HPLC是一个系统，是指泵、柱、检测器三者组成的一个完整的系统。如果只生产泵、检测器，就不能说是生产完整的HPLC仪器，只是生产了HPLC的两种部件，再买一根色谱柱组装成一台仪器后出售。所以，这样生产的HPLC系统，到了用户那里，总是不好用或者不大好用。而广大使用者，由于没有将HPLC的泵、柱、检测器三者互相影响的关系搞清楚，所以不能将HPLC用到水平(得到误差最小的分析检测数据)。以本人长期的研发和使用HPLC的实践经验，认为研发、使用HPLC时，以下问题特别值得注重：

　　正确认识、处理HPLC的泵、柱、检测器三者的关系：

　　(1) HPLC是一个系统，必须将泵、柱、检测器三者(三个部件)结合起来才能叫HPLC。三者都合格，联机后的整机系统才有可能合格，但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格，并且联机后检测结果也合格，才能说明这台HPLC是合格的。

　　(2) 三个部件都重要，不能偏重哪一方面。三者谁是核心?谁最重要?目前，光谱、色谱工作者对此看法都各不相同、各有表述，我们不必去追究这些。作者认为应该说三者是一个整体，缺一不可，都很重要。

　　(3)本人长期使用过HPLC，也研发过HPLC仪器，实践使本人深深认识到：必须将三个部件联接起来检验测试，并能达到质量指标要求，才能说这台HPLC达到了质量要求。否则，只能说是部件合格，而整机系统不一 定能合格。为什么? 因为：

　　①泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定，会影响HPLC系统的质量;

　　②柱对泵影响很大：柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定，会影响系统不稳，使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低;

　　③柱对检测器影响很大：柱效降低(柱塔板数降低)、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。

　　请注意：色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论”的盆底，比较稳定了。所以，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是：用户换新柱后，一般不检测系统的综合指标。如果检测指标，可能就不能达到原出厂指标(因为泵和检测器经过较长期使用后，质量会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到配备)，但是不会影响使用。

　　用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范(JJG)得到佐证。JJG检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测系统的指标，只有系统指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵、同样都是允许的。

2、使用者应该对色谱柱及柱外的有关问题引起高度重视

　　1)色谱峰拖尾：与柱、流动相的流速、试样等有关，发现拖尾一定要从这些方面查找原因;

　　2)如何延长色谱柱寿命：保养很重要，长期不用时用甲醇浸泡着，严格控制洗柱时间或洗柱溶剂体积，一般经常使用的柱，下班时应该用甲醇(或水：甲醇为20：80)洗 45分钟或20倍床体积;

　　3)必须注意对“柱外效应”的控制。所谓“柱外效应”,就是指HPLC系统中，除柱系统外，管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应。

　　4) 进样：自动进样时，应该经常检测自动进样器，对仪器进样器要求稳定可靠;手动进样时，应该特别注意取样时的细节，进样时的手感(轻、重、缓、急)等。

3、HPLC的使用者应该特别注重对色谱柱质量的判断

　　1)色谱柱的柱效：塔板数高者好，特别要注意影响柱效的因素，塔板数降到一定程度该柱就报废了。

　　2)重复性：一根柱子反复使用时，RSD能够保持小于0.1%。

　　3)耐用性(寿命)：因为柱效很容易降低，所以需要重视对柱的保护。

　　4)色谱柱使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。一般应该用20倍床体积冲洗，隔几天再用的HPLC，用20%甲醇：80%水冲洗30分钟左右后，再用纯甲醇冲洗20分钟 后保存。

4、HPLC的使用者应该特别重视流动相问题

　　1)PH值特别重要：一般C18柱PH小于3时，容易损坏色谱柱，但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。

　　2) 注意选择试剂的截止波长：如乙腈截止波长215nm、丙酮截止波长330nm、正丁烷210nm等等(具体情况请读者参阅本文的参考文献)。

　　3)流速：流速要适当，否则影响峰形、浪费溶剂，一般常规分析工作大多选择1ml/min。

5、使用者应该注重溶剂前处理

　　使用HPLC级的优质溶剂，使用前必须过滤和脱气。注意以下几点：

　　1)过滤目的：

　　溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏，保证分析数据可靠。

　　2)对过滤器的要求和孔径选择方法：

　　对过滤器总的要求：速度快、溶出度小、死体积小、精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。

　　孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3µm或除菌过滤，一般选择0.2µm孔径;如果色谱柱填料直径大于5µm，则选0.45µm;如果是预过滤或过滤难过滤的样品，一般选1µm孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器!否则，不可能得到可靠的分析测试数据!

　　3)脱气：

　　主要目的是：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动，危害很大，必须除之，可以打开排空阀，大流速冲洗。

6、使用者应该注重缓冲液问题

　　1) 缓冲液使用前必须过滤。

　　2) 溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响，要注意清洁。

　　3)一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。

　　4)梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液 ：

　　例如：梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐。在保证峰不拖尾的情况下，尽可能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐; 缓冲盐浓度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点，一般50～100mM。

7、研发者、使用者还特别需要重视12个常见的技术问题。

　　这12个问题是作者的经验总结，是用好HPLC的科技工作者必须重视的问题。(请读者参考《李昌厚，高效液相色谱仪器及其应用，北京：科学出版社，2014》一书)。

8、使用者必须重视进样器的清洗问题

　　进样器或进样针请注意三点：

　　A、对进样器要求：自动进样和取样速度快、有些仪器进样时间仅17秒。

　　B、进样室要求可控:一般用帕尔帖冷却，温控范围4℃～100℃。

　　C、特别要应注意进样残留量的清洗(主要是清洗针)：

洗针后，进样残留物由前面的0.07% 降到0.05%，结果非常好。

9、使用者应该重视HPLC的线性动态范围(Linear Dynanic Range-LDR)及其测试方法

　　1)线性动态范围的定义

　　HPLC检测器的线性动态范围定义如下图所示：

国际上科技工作者对HPLC的线性动态范围的定义是：线性区(保证1%相对误差的线性区域)的吸光度值A_max，除以最小线性区(保证1%相对误差的线性区域)的吸光度值Amin。即LDR=A_max/A_min;或线性区的浓度C_max除以最小线性区的浓度C_min，即LDR=C_max/C_min。

　　2)HPLC的线性动态范围的重要性(对分析测试误差的影响)

　　定量分析检测时，如果HPLC使用在非线性动态区，肯定会因非线性而产生误差。为了保证分析测试结果的可靠性，我们应使用在HPLC的线性动态区。因此，线性动态范围是一切HPLC使用者必须高度重视的技术指标。

　　一般来说，使用者拿到一台HPLC仪器后，总是希望对很稀的样品分析时，其分析测试的结果在所要求的误差范围内。对很浓的样品分析时，其分析测试的结果也在所要求的误差范围内。这就只有HPLC的线性动态范围很宽的时候才能做到。有人认为，样品太稀时，浓缩一下就好了，样品太浓时，稀释一下就是了。这是不了解分析工作或未亲自作过分析工作的人说的话。因为，浓缩一下或稀释一下谈何容易?首先是增加工作量，稀释或浓缩工作很麻烦;第二，稀释或浓缩会带来误差。所以我们总是希望HPLC的线性动态范围大(宽)且好。

　　HPLC的线性动态范围，一般取决于仪器检测器的噪声和杂散光。国内外很多HPLC的生产厂商不给出HPLC的线性动态范围。作者认为不给线性动态范围是不对的，因为不给线性动态范围，就意味着不知道这台HPLC分析的样品浓度的上限和下限。综上所述，HPLC的线性动态范围非常重要，它将限制仪器的使用范围(即限制仪器的适用性)。很遗憾的是许多科技工作者目前还未对线性动态范围引起重视。

　　3)线性动态范围测试方法

　　HPLC的线性动态范围的测试方法有多种。我国的计量检定规程JJG705-2002规定：波长254nm时，采用“丙酮/2%异丙醇水溶液(丙酮含量为0.1%、0.2%、....1.0%)冲洗检测池，并记下各溶液对应的稳定记录仪读数;由C_H/C_L算出检测器的线性范围(C_H浓度上限、C_L浓度下限)。”作者认为这种方法很不妥。因为浓度的下限是计算出来的，不是真正测试出来的下限。采用的计算公式为：C_L=2NCV/H×20(公式本身有错误);并且算出的下限值达到千万分之三点一(即：0.000031%)。这样的数据有什么意义?作者认为这种测试线性范围的测试方法既不符合仪器学理论，又不与国际接轨，有关部门应该尽快更正。

　　目前，国际上对线性动态范围的测试方法，一般是配置不同浓度的标准样品(以数量级递增)，直接在仪器上测试其吸光度。求出偏离比耳定律1%时的吸光度A_max和最小吸光度A_min。二者相除即是仪器的线性动态范围LDR(Linine Dinamic Rangi)。即LDR=A_max/A_min。其具体操作是：HPLC仪器设置纵坐标为吸光度A，横坐标为浓度C;检测器的光谱带宽为2nm;波长设置可以在紫外区(如要求很高时可设置在253.7nm)，也可在可见区(如500nm);试样可任选，浓度从小到大，依次对所配试样进行测试。作曲线，从曲线上找出偏离线性在1%以内的范围。此范围内的A_max/A_min就是线性动态范围。

　　作者在研发HPLC的UV/FLD时，就是根据仪器学理论，从线性动态范围的物理概念出发，自己配置蒽不同浓度的溶液，以数量级递增，测出能保证1%相对误差的下限点和上限点，二者相除，得出其线性动态范围，效果非常好。