与所有其他基因组模式一样，CRISPR/Cas 基因疗法必须以高效且对患者友好的方式实施。然而，当前的基因递送方法已出现脱靶效应而且缺乏有效的敲除效率。

本次内容中，来自图宾根大学医学院眼科研究所的 Pietro De Angeli 博士和 the Princess Maxima Center的Maarten 博士讨论了 CRISPR/Cas 9 递送方法的安全性，以及涉及可扩展性和人工智能 (AI) 方法使用的当前趋势。

01 聚焦安全性特性：CRISPR/Cas 递送中的 DNA、mRNA 和 RNPs

为了让 CRISPR/Cas9 基因编辑无缝工作，复合体必须到达细胞核以便能够定位目标基因。

CRISPR 递送由质粒 DNA（pDNA）、mRNA 或核糖核蛋白 （RNPs） 介导，前两者对安全性造成挑战。通过质粒 DNA 或 mRNA 递送通常会触发先天免疫反应，而 pDNA 并入宿主基因组的风险增加，从而导致长期的不良影响。尽管体外策略可以预测和减轻这些风险，但 CRISPR/Cas9 的特异性问题仍未解决。

CRISPR/Cas9 机制。通过先结合导向 RNA，再结合紧挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因组序列来激活 Cas9 酶。然后，Cas9 酶会引起双链断裂，并通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向重组 (HDR) 途径修复 DNA，从而形成编辑后的基因序列。

为了降低基因编辑的风险，科学家们正在转向 RNP，RNP 由 Cas9 蛋白与靶向 gRNA 复合而成。这种递送方法提供了更优的特异性和安全性。Maarten 指出迄今为止，复合物在宿主内的时间与 CRISPR/Cas9 基因编辑的精确度之间呈负相关：“mRNA 或 DNA 需要长达一周的时间来进行 Cas9 的转录和翻译，而 RNP 一旦进入细胞核就立即开始工作，并在不到 24 小时内完成任务。Cas9 在细胞核中停留的时间越长，就越有可能找到并积累脱靶位点。这就是为什么安全的基因编辑方法是通过 RNP 提供非常短暂的 Cas9 脉冲。”Pietro 补充说，RNPs 的另一个优势是易于优化。“当使用 RNPs 时，更容易调整试剂的浓度，这会影响目标效率。而在基于 DNA 的 CRISPR 递送中，很难预测和微调转染效率和 DNA 拷贝数。”

基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR/Cas9 面临的另一个挑战是，它可能会改变宿主的转录组和蛋白质组特征。这种转变主要发生于宿主为 DNA 和 mRNA 形式的转录和翻译重新组织其能量资源。由此产生的代谢负荷会扰乱宿主代谢，从而改变转录组和蛋白酶体。相比之下，作为 RNP 的 CRISPR/Cas9 递送是一个可以发挥作用并进行所需基因编辑的复合体，因此不会导致基因组向表达 Cas9 的方向转变。

02 体外应用：探索 CRISPR 的可扩展性和可行性

CRISPR/Cas9 系统不能作为裸复合体递送到细胞核中，因此适当的 CRISPR 递送载体在保护复合体完整性方面起着重要作用。为了解决当前的问题，科学家们分享了来自研究实验室的开创性工作。

麻省理工学院和哈佛大学的博德研究所副主席 David Liu，他设计了病毒源的脂质纳米颗粒（LNPs），可以包裹这种复合物。LNPs 在所有形式的 CRISPR/Cas9 中都展示出了高效的递送效果，包括预先形成的 RNP。这种机制将复合物的递送引导到特定相关的器官（Banskota 等人，2022，Cell 185，250–265）。与此同时，Jennifer Doudna 的实验室通过在蛋白的 C 端和 N 端添加核酸定位信号来增强 Cas9 的位点特异性，体内实验证实了在小鼠大脑中进行精确的基因编辑（Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438）。

虽然递送方法不断改进，但 CRISPR/Cas9 基因编辑的临床潜力尚未实现，主要是因为与长时间脱靶编辑相关的病毒递送仍然是金标准。在非病毒递送方法中，电穿孔因其与 RNPs 兼容的安全可靠的递送能力脱颖而出。这种方法在细胞膜上穿孔，允许 RNP 无缝进入细胞质，并防止其内吞或逃逸。

在可扩展性方面，又出现了一系列问题。虽然 Cas9 核酸内切酶可以大批量生产且成本低，而 gRNA 不仅对疾病或治疗方法具有特异性，而且对个体也具有特异性。Pietro 认为，gRNA 规模化的道路充满了风险。

“目前，我认为问题不在于技术本身，而在于法律框架。大型制药公司更关注更常见的疾病，因为他们在寻找商业上可行的机会。属于这一群体的患者更有可能接受基因编辑治疗。对于罕见病的治疗，学术和非营利研究机构必须努力为患者提供便利。”据 Maarten 说，罕见疾病的监管程序必须有所不同 “对于每种疾病，都必须通过大量的体外数据来证明复合物的安全性。对于全球患者数量有限的罕见疾病，生成这样全面的报告是不可能的。“目前，Jennifer Doudna 和其他 CRISPR 专家发起的倡议正在与 FDA 协商，以放宽对罕见疾病的临床前数据要求和 IND 备案。”该提案涉及使用体外基因编辑来生成编辑后的细胞，然后重新注入患者体内，从而使基因组编辑被视为一种试剂而非药物。”

03 增强 CRISPR 精准医疗：CRISPR/Cas 与 AI 及 ML 的协同作用

机器学习（ML）和人工智能（AI）工具——类似于它们在其他许多领域中发挥的作用一样——被认为是基因编辑和基因驱动药物发现领域的变革者。就 CRISPR/-Cas9 而言，它们可用于组装位点特异性和脱靶编辑的大型数据集，并将这些数据集与不同的碱基编辑器或 3D RNP 结构关联。机器学习算法可以针对特定基因给出所需的 gRNA 序列，并且实现特异性水平所需的蛋白质层面上的所有修饰。因此，科学家现在可以设计最安全、最有效的 gRNA。

AI 工具还被用于预测进化程度更高的 CRISPR/Cas9 变异体的疗效。为了改进引物编辑，研究人员开发了 nCas9 (融合为逆转录酶的 Cas9 nickase) 以简化各种基因组编辑类型，如点突变、插入和缺失。虽然这一新型系统在理论上能提供更好的初始编辑效率，但其设计和安全性必须得到全面评估，这正是 AI 工具预测能力发挥作用的地方。Maarten 再次强调了 AI 在基于基因的药物发现中的价值：“它帮助我们扫描数百种 Cas9-gRNA 组合，以检测出表现优秀的前 10 种组合。”

04 CRISPR 的未来：改变治疗方法

传统的基因组测序不足以阐明疾病的遗传背景。虽然研究人员可以从一名患者中分离细胞，并将这些基因组与健康的基因组进行比较，但这种比较并不一定能涵盖导致疾病表型的数千个点突变。CRISPR/Cas9 基因编辑技术有助于克服这些障碍，并极大地受益于详细的疾病建模和针对特定突变的个性化医疗。对 Pietro 来说，治疗只是问题的一方面，“我们不仅可以将 CRISPR/Cas9 用作治疗工具，还可以将其用作疾病研究的手段。3D 细胞模型，如诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官，这对于模拟复杂的人类生物学极为宝贵。因此，通过在 iPSC 基因组中引入与疾病相关的突变，我们可以生成能够分化为疾病表型的细胞培养物。” CRISPR/Cas9 的这一方面值得关注，因为疾病的遗传背景对开发强有力的治疗工具至关重要。

当然，3D 细胞建模的作用也不可高估。通过 3D 细胞培养技术和 CRISPR/Cas9，研究人员可以生成等基因细胞模型，该模型仅包含从少数患者提取的细胞的整个基因组景观。

结论 — CRISPR 研究与应用的未来

CRISPR/Cas9 开启的治疗机会是广阔的，特别是在体外编辑点突变和基因修复方面以及在未来的体内修复方面。这可以增加携带既往难以靶向突变的罕见疾病患者的治疗机会。

值得注意的是，CRISPR 并不是一个万能的解决方案。特别是当谈到癌症时，它并不能否定化疗方法的价值。相反，它可以通过深入探究疾病的基因组根源来产生协同效应，而药物复合物则在化学酶水平上抑制与疾病相关的机制。将 CRISPR 与 FDA 批准的药物相结合，可以加速其在主流临床癌症治疗应用中的普及。

Molecular Devices 致力于通过创新的工具和解决方案来优化 CRISPR 技术，助力研究人员实现基因修饰的精准与高效。我们的产品覆盖 CRISPR 工作流程的各环节。

参考文献

Banskota等人，2022，《Cell》185，250–265
Stahl EC等人，Mol Ther. 2023年8月2日；31(8):2422-2438