DNA提取方法的有效性和回收率比较：手动均质化与Spex Genomax®
时间：2024-01-22 阅读：606
有效地均质化生物组织和破坏细胞的能力对于产生足够质量和数量的DNA和RNA研究所需的核酸至关重要。此外，由于其整体异质性或实验室接收到的状态，许多样品需要均质化或减小颗粒大小以创建代表性样品。均匀性是指在整个样品中具有一致组成状态，而异质性则在一个或多个特征上缺乏一致性。
实验室或分析样品必须经过处理，以便进行提取、加工或消化以进行进一步测试。在生物样品中，均质化可以通过破坏生物组织和溶解细胞来加速处理速度，从而允许提取遗传物质。获得均匀样品的最常见方法是研磨或粉碎，这可以提高准确性并减少不确定性。在实验室中，一些科学家使用手动或半自动的方法进行组织处理，这可能会耗费时间并且产生的样品可能没有完荃均质化。实施自动化的均质化和处理可以提高样品的处理量，同时从生物材料中更快地恢复DNA/RNA。
这项研究将证明使用自动化均质化方法在节省时间方面的效率，以及对遗传物质的回收和提取的改进。在之前使用Spex Geno/Grinder®的研究中，发现农业和环境产品的农药提取大大增强了回收率，同时显著缩短了样品制备的处理时间。
在这项新的研究中（由Spex和HoppeSyler共同进行的联合项目），使用手动小球搅拌器和自动化均质器（Spex Genomax）来破坏各种生物组织，然后在进行基因组DNA（gDNA）分离之前。分离的gDNA随后用于下游敏感的应用中，以确定手动与自动均质器在分析学和分子生物学研究中的有效性。
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方法和材料
该工作流程主要涉及三个过程：1. 组织均质化；2. DNA提取；3. DNA分离。
组织均质化
将60毫克的新鲜组织加入500微升的DNA结合缓冲液和20微升的蛋白酶K（20 mg/mL），这些试剂来自Spex DNAmax动物基因组DNA分离试剂盒。根据制造商的协议进行组织的均质化和处理。然后将样品在55ºC下以700 rpm的速度轻轻摇动15分钟进行孵育。在蛋白酶K消化后，向裂解物中加入20微升的RNase A，并在室温下孵育五分钟，然后加入200微升的>95%乙醇。然后通过涡旋器将裂解物剧烈混合五秒钟。
DNA提取和柱清洗
涡旋后，将700µL裂解物加载到DNAmax试剂盒提供的硅胶旋转柱上，并在室温下以13,000 xg离心一分钟。丢弃流过液，并将500µL来自试剂盒的洗涤缓冲液A（添加了乙醇）添加到柱中，再次离心三分钟。丢弃所得的流过液。
DNA分离和洗脱
将柱子离心额外一分钟，并丢弃收集管。向柱子中加入100 µL的EB或TE缓冲液（pH 8.0），并在室温下静置三分钟，然后再次离心一分钟。收集含有纯化的gDNA的流过液进行分析和qPCR。
手动 VS Genomax：核酸分离和回收
在比较手动和自动研磨的第一次研究中，各种动物组织（牛里脊肉、鸡胸肉和小鼠心脏）的样品经过均质化、提取和分离gDNA的处理。使用手动均质化的样品平均处理时间超过200分钟（接近2个半小时），而使用Spex Genomax的时间不到1/2小时（图1）。使用自动化的Genomax方法，处理时间减少了超过86%。
图1. 使用手动和Genomax处理gDNA均质化、提取和分离的处理时间
比较了三种动物组织（牛里脊肉、鸡胸肉和小鼠心脏）中提取的遗传物质的质量和数量。牛里脊肉和鸡胸肉代表了不同密度的动物肌肉组织。小鼠心脏代表了难以均质化的纤维状动物器官组织。传统上，高密度和纤维状组织最难均质化，并且产生的可回收gDNA量最少。使用手动方法和Genomax处理后，分离gDNA并使用紫外/可见光谱法测试浓度（图2）。
图2. 使用手动和Genomax方法在不同动物组织中回收DNA
手动方法通常会导致DNA提取和分离不完整，而使用Genomax进行自动化均质化手动方法通常会导致DNA提取和分离不完整，而使用Genomax进行自动化均质化可以实现完荃的均质化和高效的提取，如图3中的电泳凝胶所示。
图3. 使用手动和Genomax自动化均质化处理的DNA的凝胶电泳
在这项首冫欠研究的一项后续研究中，使用商用手动小球混合器和Spex Genomax均质器对30毫克的小鼠心脏进行均质化。根据制造商的建议，使用手动均质器对小鼠心脏进行均质化，而Genomax中的组织则经过三轮均质化处理，每轮以1500 rpm的速度均质化1分钟，每轮之间有20秒的暂停。使用Spex DNAmax试剂盒分离DNA，并使用涵盖小鼠Ostβ启动子或Hic1基因体的引物制备用于qPCR分析的样品。每个分析都进行了双重检测。与手动均质化相比，发现Genomax的产量增加了35倍。实际上，在使用0.25 µL至1 µL的分离gDNA时，Genomax样品产生了强烈的曲线，而使用手动均质器分离的gDNA生成了1 µL的扩增曲线（图4）。
图4. 小鼠有机溶质转运β启动子的复制。9号染色体，65330248-65330323(75个碱基对) ，使用Genomax和手动处理
使用较小体积的gDNA（0.25 µL和0.5 µL）时，目标基因的扩增在使用Genomax时被证明是成功的，而通过手动处理分离的gDNA未能产生任何信号（图5）。
图5. 低样品体积下，使用手动方法和Genomax复制小鼠高甲基化癌症1基因体的结果对比。染色体11，75058091-75058200（109个碱基对）
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结论
自动化的均质化和细胞裂解过程提高了处理的效率，无论是在时间上还是在最终的gDNA提取上。使用Genomax等自动化过程，目标gDNA的质量和数量以及复制性都显著提高，特别是与Spex DNAmax提取试剂盒结合使用时。总体而言，使用Genomax处理样本的时间大大减少到不到半小时，并且在较低的样品体积下产生更多可复制的遗传物质副本。