【Application Note】磷酸肽的高效合成
时间:2023-12-04 阅读:474
摘 要
使用具有 CarboMAX™ 偶联方法的 Liberty Blue™ 自动微波肽合成仪能进行难以合成的磷酸肽的高效合成。微波能量的使用被证明对于偶联庞大的磷酸氨基酸衍生物非常有效,而使用CarboMAX 偶联方法可以在高温下保护酸不稳定的受保护磷酸基团,从而最大限度地减少副反应。使用这种方法,在不到 2 小时内分别组装了以下磷酸肽:CTEDQY(pS),LVED-NH2(82% 纯度)、CPSPA(pT)DPSLY-NH2(73%纯度)和CSDGG(pY)MDMSK-NH2(62% 纯度)。
简 介
磷酸化是一种翻译后修饰 (PTM),它涉及将磷酸基团引入肽或蛋白质的苏氨酉夋、丝氨酉夋或酪氨酉夋残基上1。酶促磷酸化调节许多蛋白质的功能并引导许多细胞内信号转导级联2。由于磷酸化在生物学中的不可或缶夬的作用,近年来对磷酸化肽合成的兴趣稳步增长,特别是随着细胞生物学家和蛋白质组学研究人员寻求更好地理解和表征磷酸化蛋白质组3。最初,磷酸化肽的生产需要合成整个肽,然后是合成后的磷酸化步骤。这种合成后方法通常难以实施,而且经常产生不纯的肽4。引入 Fmoc 衍生的单苄基保护的磷酸氨基酸,例如 FmocThr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH 和 FmocTyr(PO(OBzl)OH-OH(图1)显着改进了合成过程,并成功实现了 SPPS 的自动化,适用于各种磷酸肽。5
图1. Fmoc 衍生的单苄基保护的磷酸氨基酸
微波能已被用于合成磷酸肽。先前已证明偶联磷酸氨基酸后的第一次脱保护应在室温下进行,以防止受保护的磷酸基团的β-消除。此外磷酸键对酸不稳定,因此在碳二亚胺偶联过程中易于在高温下去除。使用 0.4 当量 DIEA 的 CarboMAX 方法对于稳定酸敏感键(包括受保护的磷酸基团)非常有效。CarboMAX 最近被证明可以成功合成含有 3 个受保护的磷酸基团的磷酸肽。微波偶联步骤已被证明可以改善磷酸化残基的直接和后续偶联,并最大限度地减少去磷酸化和缺失产物 (CarboMAX)6。
材 料 和 方 法
试 剂
所有氨基酸均获自 CEM Corporation (Matthews, NC) ,并含有以下侧链保护基团:Asn (Trt)、Asp (OMpe)、Cys (Trt)、Gln (Trt)、Glu (OtBu)、Lys( Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)。Fmoc 单苄基保护的磷酸氨基酸也得自 CEM Corporation (Matthews, NC):N-α-Fmoc-O-苄基-L-磷酸丝氨酉夋 (pS)、N-α- Fmoc-O-苄基-L-磷酸酪氨酉夋 (pY)、和 N-α-Fmoc-O-苄基-L-磷酸苏氨酉夋 (pT)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTide™ LL 树脂购自CEM Corporation (Matthews, NC) 。N,N'-二异丙基碳二亚胺 (DIC) 购自 CreoSalus (Louisville, KY)。哌啶获自Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙酉夋 (TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三异丙基硅烷 (TIS)、N,N-二异丙基乙胺 (DIEA) 茴香硫醚和乙酸购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和无水乙酉迷 (Et2O) 购自 VWR (West Chester, PA) 。LCMS 级水 (H2O) 和 LCMS 级乙腈(MeCN) 购自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。
多 肽 合 成
使 用 CEM Liberty Blue 自 动 微 波 肽 合 成 仪 在 Rink Amide ProTide LL 树脂(0.20 meq/g 取代)上以 0.1 mmol 规模制备肽。用哌啶和 Oxyma Pure 在 DMF 中进行脱保护。偶联反应使 用 5 倍 过 量 的 Fmoc-AA-OH、DMF 中 的 DIC 和 DMF (CarboMAX) 中的 Oxyma Pure/DIEA 进行。6在 CEM Razor™ 上使用 TFA/茴香硫醚/TIS/H2O/DODT 进行裂解平行肽切割系统。裂解后,肽在无水乙酉迷中沉淀并冻干过夜。
结 果
在 Liberty Blue 自动微波肽合成仪上 CTEDQY(pS)LVED-NH2 的微波增强 SPPS 产生了纯度为 82% 的目标肽(图2)。没有观察到 Tyr 缺失。CPSPA(pT)DPSL Y-NH2 的微波增强 SPPS 产生了73% 纯度的目标肽(图3)。观察到少量7-11位氨基酸的截断。CSDGG(pY) MDMSK-NH2 的微波增强 SPPS 产生了 62% 纯度的目标肽(图4)。观察到最小的天冬酰胺形成和甲硫氨酉夋氧化。
图2. CTEDQY(pS)LVED-NH2的UPLC色谱
图3. CPSPA(pT)DPSLY-NH2的UPLC色谱
图4. CSDGG(pY)MDMSK-NH2的UPLC色谱
结 论
Liberty Blue 自动微波肽合成仪上的微波增强型 SPPS 可快速高效地生产高质量的磷酸肽,例如 CTEDQY(pS)LVEDNH2、CPSPA(pT)DPSLY-NH2 和 CSDGG(pY)MDMSK-NH2。插入磷酸丝氨酉夋后的室温去保护最大限度地减少了CTEDQY(pS)LVED-NH2 合成中的去磷酸化。使用 Fmoc-Asp(OMpe)-OH 可最大限度地减少敏感序列中天冬酰胺形成的发生,尤其是 CSDGG(pY)MDMSK-NH2。微波增强的 SPPS 可以改善磷酸化残基的直接和后续偶联,同时最大限度地减少不必要的副反应。
参考文献
(1) Prabakaran, S.; Lippens, G.; Steen, H.; Gunawardena, J. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2012, 4 (6), 565–583.
(2) Chen, J.; Shinde, S.; Koch, M.-H.; Eisenacher, M.; Galozzi, S.; Lerari, T.; Barkovits, K.; Subedi, P.; Krüger, R.; Kuhlmann, K.; Sellergren, B.; Helling, S.; Marcus, K. Sci. Rep. 2015, 5 (1), 11438.
(3) Dephoure, N.; Gould, K. L.; Gygi, S. P.; Kellogg, D. R. Mol. Biol. Cell 2013, 24 (5), 535–542.
(4) White, P. D. In Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Chan, W. C., White, P. D., Eds.; Oxford University Press: New York, 2000; pp 187–189.
(5) Perich, J. W.; Ede, N. J.; Eagle, S.; Bray, A. M. Lett. Pept. Sci. 1999, 6 (2/3), 91–97.
(6) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”