利用微波快速高效水解宠物食品中的氨基酸
时间：2022-11-09 阅读：571
介绍
蛋白质在湿宠物食品和干宠物食品的生产过程中起着重要作用。蛋白质的质量和数量不仅影响生产的总成本，还影响消费者对产品的兴趣。评估膳食蛋白质质量的一种方法是通过氨基酸水解检查样品的总氨基酸含量。通常，蛋白质在酸性或碱性条件下水解24小时以上。这种处理打破了蛋白质中氨基酸残基之间的肽键，最终实现了每个氨基酸的鉴定和定量。由于常规加热的特点是缓慢的体积加热、不稳定的热梯度和不一致的反应产率，因此需要较长的反应时间。
微波辅助反应已被强调为一种显著缩短水解时间、提高反应产率和重现性的方法。1,2 CEM的Discover®2.0微波反应器为优化蛋白质水解反应提供了一条级好的途径。在此，对湿和干宠物食品进行传统的酸水解以及优化的微波辅助水解条件。使用Waters AccQ Tag™ 超衍生试剂盒，通过柱前衍生法测定每个样品的氨基酸含量，然后在260nm下进行LC-PDA分析。总的来说，Discover 2.0的结果较优于传统水解，且具有关键的优点，包括更短的反应时间、更清洁的水解产物和更快的分析时间。
材料和方法
试剂和样品
化学品从商业供应商处购买，未经进一步纯化即可使用。用于传统和微波辅助氨基酸水解的溶液在使用前新鲜制备。所有玻璃器皿在110°C的空气烘箱中干燥4小时。所有宠物食品样品均化并储存在阴凉干燥的地方（对于干样品）或4ºC（对于湿样品），直到分析。使用分析天平将每个样品的40至50mg部分称重到其反应容器中。使用Waters AccQ Tag Ultra Derivation试剂盒分析所有样品，用于260nm下的LC-PDA分析。
传统酸水解法
将宠物食品样品加入清洁干燥的10 mL玻璃瓶中，然后加入2mL 6 N HCl。然后用N2吹扫小瓶，快速密封，然后放入110°C 空气烘箱中24小时。将样品水解物冷却至室温，然后通过0.2 µm PTFE过滤器。然后用6M NaOH中和无颗粒样品，以准备AccQ Tag衍生化。
Discover 2.0 水解方法
水解反应制备：将各样品的50 mg部分添加到配备有微搅拌棒的35mL Pyrex容器中。用移液管将5mL体积的含1%本酚（w/v）的6N HCl移到每个容器中。用N2流吹扫容器5分钟，用Tefon内衬硅帽快速密封，并放置在自动取样器架中，以便自动放置到Discover 2.0腔中。反应完成后，将冷却的样品中和并过滤，以准备AccQ Tag™ 衍生化。
方法编程：在Discover 2.0系统中编程一步动态法，用于宠物食品样品的氨基酸水解。
酸水解
容器类型：Pyrex
控制类型：动态
温度：160°C
时间：30分钟
压力：300 PSI
功率：300 W
搅拌：高
分析样品制备
对于AccQ Tag衍生化，将来自Waters AccQ Tag-Ultra衍生化试剂盒的70µL硼酸盐缓冲液添加到完整的回收小瓶中，然后添加10µL过滤和中和的样品。将小瓶盖上并使用旋涡混合器混合。此外，将20µL从Waters试剂盒制备的衍生化试剂添加到每个样品反应中，移液管jian端直接置于反应溶液中。在分析之前，将总反应涡旋10秒，然后在55℃下加热10分钟。
分析
将4µL每种衍生反应注入ACQUITY™上变频器™ 系统，连接到Waters PDA探测器。在Waters AccQ Tag Ultra C18柱（1.7µm，2.1 x 100 mm）上以0.4 mL/min的流速进行分离。柱温为55℃。洗脱梯度如表1所示。流动相为A:Waters AccQ Tag洗脱液A，在MilliQ水中稀释10倍，B:Waters-AccQ Tag-Eluent B。为了测定每种氨基酸的氨基酸浓度，将Waters氨基酸标准品（Waters Corporation，零件号WAT088122）衍生为以下浓度：1、5、10、25、50和100 pmol/µL，并且所得到的线性曲线被强制通过零。所有分析均使用Waters TargetLynx软件™进行。
表1. 用于衍生氨基酸分离的梯度
结果和讨论
使用CEM的Discover 2.0微波反应系统对干狗（猫）粮和湿宠物食品样品进行微波辅助氨基酸水解。每种水解产物的氨基酸含量通过柱前衍生化测定，随后通过配备PDA检测器的LC分析测定，PDA检测器设置为在260nm下监测。将结果与从相同样品的传统烘箱水解反应获得的结果进行比较。传统的结果被认为是100%的回收率。表2描述了每个氨基酸残基与其传统水解对应物的回收率。对于干和湿宠物食品样品，所有回收率均在可接受的回收率范围内，即60至130%。此外，与传统水解反应相比，微波辅助反应的标准偏差更高（如图1所示）。
与传统水解反应相比，微波辅助反应在标准偏差方面表现出更高的精度（如图1所示）。
Discover 2.0与传统氨基酸水解协议相比具有多种优势。添加磁搅拌有助于样品的均匀性，而压缩空气冷却使反应容器在几分钟内达到安全的处理温度。Discover 2.0的微波加热机制提供了与传统加热相当的结果，在30分钟内提高了精度，从而缩短了分析时间，并为反应优化提供了更大的机会。该方法还代表了用于酸和碱氨基酸水解反应的安全和自动化平台。
表2. 干湿宠物食品中氨基酸的回收率——微波辅助与传统氨基酸水解
图1. 湿宠物食品的氨基酸水解结果
结论
这项研究强调了CEM的Discover 2.0是一种有效的方法，可用于湿宠物食品和干宠物食品的氨基酸水解。总的来说，Discover 2.0的结果在准确性和精密度方面较优于传统的烘箱水解结果，主要优点是反应时间更短、水解产物更清洁、分析时间更快。
参考文献
1 Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.
2 Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.
AccQ-Tag™, ACQUITY™ UPLC™ , and TargetLynx™ are trademarks of Waters Corporation.