临床中，心力衰竭期间心律失常的发生是一个需要关注的问题。区域电梯度引发心律失常，细胞离子跨膜梯度是其起源。英国和意大利研究人员Michele Miragoli等研究了衰竭心脏心肌细胞的纳米级机械敏感特性是否与异常电活动的启动有关。通过纳米吸管产生液力喷射，在肌膜特定位置形成凹痕，启动胞内钙释放。发现健康细胞中钙jinxian于局部区域，而衰竭心肌细胞中会传播扩散。心力衰竭使膜逐渐变硬并使肌膜下线粒体位移。秋水仙素处理可通过硬化细胞、破坏微管、移动线粒体及引发钙释放来使健康细胞模拟衰竭。线粒体质子梯度的解偶联可消除衰竭细胞和秋水仙素处理细胞中的钙启动。因此微管依赖的线粒体机械传感因子微区的破坏，可能是心力衰竭时异常钙释放的一种机制。文章以“Microtubule-Dependent Mitochondria AlignmentRegulates Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in HeartMyocytes”为题发表于Cell Reports。

背景

       泵衰竭和心脏性猝死是临床治疗面临的重要挑战。心力衰竭时，机械敏感性的改变可引发电不稳定和心律失常。使用原位完整心脏、离体心脏和离体细胞制剂，对促心律失常的机械电传导已经有了广泛研究，但信号传导及其启动所需的初始亚细胞机制仍不明确。已知肌节中，除产力之外还有些肌节蛋白可提供机械传感和/或信号功能，这些肌节或Z盘复合蛋白的突变会导致细胞内Ca2+应答异常。

       心力衰竭时，细胞骨架重塑，可能会干扰机械感觉的正常调控，而缺乏适当的机械反馈控制可能会促进心力衰竭发展。心力衰竭期间发生的结构重塑涉及细胞膜（T小管缺失）、闰盘以及膜下微域，如兰尼碱受体（RyRs）和肌质网。已知心肌梗塞早期，胞内线粒体位置、纤维间线粒体排列发生改变，而线粒体及二分体的规则排列在兴奋-收缩偶联和细胞内钙处理稳态中起着关键作用。关于线粒体重塑在机械电转导诱导的心律失常中的可能作用，我们了解甚少。因此许多传统技术无法选择性地机械激活或研究单个肌膜微结构域内的线粒体参与情况。本研究采用扫描离子电导显微镜（SICM）和表面共焦SICM来解决细胞拓扑结构和线粒体定位问题。

        通过纳米精度的SICM纳米吸管施加压力，研究心力衰竭时机械诱导钙释放的亚细胞机制（图1）。健康心肌细胞中，以规则的Z-grooves为目标的水力喷射，可引发机械诱导的细胞内钙释放（MiCai）事件，且MiCai空间受限。在Z-grooves不规则的衰竭心肌细胞中，MiCai则会传播至整个细胞。产生传播性MiCai的可能性与线粒体紊乱程度，以及施力点膜顺应性降低有关。排除机械敏感离子通道和肌动蛋白丝后，观察到可通过破坏健康心肌细胞中负责维持肌膜下线粒体位置的微管来模拟MiCai传播。线粒体质子梯度的解耦会消除MiCai传播。似乎与线粒体相关的微管可能代表一个信号微区，可对肌膜机械刺激做出反应。研究表明在心力衰竭进展过程中，微管和线粒体紊乱在异常钙释放的启动中起着关键作用，为非动作电位介导的细胞内钙释放提供了一种解释机制。

结果

01-衰竭心肌细胞的结构与力学特性

       在心肌梗塞（MI）后不同时间点，使用SICM扫描正常和衰竭心肌细胞（主要来自代偿性肥大，远离瘢痕区域）的肌膜结构特征。根据拓扑图像，将移液管定位于肌膜上200nm处定（嵴或Z-groove或无结构区域）（图1A）。随后施加局部20kPa的水力喷射2s。水力喷射凹陷面积（图1B）在0.125 μm2范围内。

图1 实验方案示意图。(A)5 μmol/L Fluo-4 AM处理细胞，SICM扫描细胞表面。纳米管置于嵴或groove上方，保持200 nm距离不变，施加水射流压力。根据Clampfit 10.0 (Molecular Devices)设置采集光闸(1-5KHz采集共8s)和压力泵(20kPa持续2s)。记录Fluo-4荧光发射(颜色编码的延时图)、Z向压电位移(膜压痕)和机械诱导的钙起始及传播。右为压力、Z向压电位移和钙瞬态读数距离。(B)离体心肌细胞中，20 kPa水射流压力2s后的扰动区域。移液管填充1mM荧光黄，得到约0.125μm2区域(绿点)，插图为放大。

       以大鼠为模型研究心肌梗塞后发展为心力衰竭的心肌细胞，模型在16周出现心力衰竭，有明显的肥厚及左心室衰竭。首先获得正常或衰竭心肌细胞10×10μm大小的SICM拓扑图像，用于量化表面结构规则性的破坏情况，可见肌膜规则性逐渐改变（图2A）。测量心肌梗塞后16周的Z-groove指数，发现从对照心肌细胞的0.62±0.16显著降低到0.44±0.19（图2B）。因此心肌梗塞后，膜组织发生了实质性的改变，包括嵴（crests）和沟（grooves）的消失。

       为研究细胞表面微区的机械特性，在细胞光滑或沟区施加0-40kPa（通常20kPa）水力喷射2s，记录移液管的垂直位移。移液管由SICM反馈控制机制驱动，随细胞表面移动，记录膜位移（Z向）与压力做函数。发现正常细胞中，沟周围区域比嵴处硬，施加相同压力移液器位移更少，但衰竭的细胞哪个区域的膜都比较硬（图2D）。

       心力衰竭发展期间，心肌梗塞后4周细胞表面规律性开始发生变化，但不明显（图2A和2C）。肌膜的膜顺应性显著减少（图2D）。8周时结构逐渐丧失，肌膜比对照细胞更硬。水力喷射后的膜顺应性数据计算弹性杨氏模量，发现整个肌细胞表面的模量变化很大（图2D）。

图2 向心力衰竭发展时，MiCai传播从局部向整体变化。（A）左上为AMC心肌细胞表面；右上为心力衰竭细胞；左下为MI 8周的细胞；右下为MI 16周。（B）向心力衰竭发展期间MiCai传播频率。（C）Z-groove指数。（D）20kPa压力施加2s后的膜顺应性。

02-衰竭心肌细胞中的MiCai

       健康的对照心肌细胞中，施加于Z-groove的压力启动了局部MiCai，特征是扩散相对缓慢，并且空间上局限于压力部位（图3A左）。而在衰竭心肌细胞中，MiCai始于压力部位并传播扩散至整个细胞（图3A右）。衰竭细胞中MiCai传播更快（达到峰值的时间更短），对照心肌细胞主要表现为局部MiCai，达到峰值总时间为252.4±11ms，而衰竭心肌细胞主要为传播性MiCai，到达峰值时间为134±26ms（图3B）。研究MiCai的特征和动力学发现，衰竭细胞中的MiCai事件的持续时间比对照细胞长，且振幅更高（图3B）。随着心肌梗死后细胞重塑并向心力衰竭发展，MiCai传播的概率和频率增加。心肌梗塞后4周，传播性MiCai的出现频率只是略高于对照，而心肌梗塞后8周，液力喷射后传播出现的频率更高（图2B）。

       通常衰竭的心肌细胞表现出两种不同的MiCai起始和传播模式。一重是出现一个孤立的“波纹”，从压力点下方开始并逐渐传播至整个细胞，发生在心肌梗塞后4、8和16周的所有时间点。另一种更为复杂，MiCai波从压力点下方开始，但1或2ms后，会有一个或多个来自细胞外围的远程MiCai信号（二进制出现）跟随初始波。随后三重Ca2+波正面碰撞并快速传播至整个细胞。

03-MiCai起始与L型钙通道、肌浆网、拉伸激活通道或肌动蛋白细胞骨架无关

       从0到低（0.1μmol/L）再到“生理水平”（1.8μmol/L）改变胞外Ca2+浓度，发现不会影响MiCai频率。nifedipine处理（抑制钙内流）也未能阻止MiCai发生（图3C左下）。Caffeine（RyR激动剂）处理发现，尽管高剂量Caffeine会使RyR2打开，但不会改变正常和衰竭细胞中已传播MiCai的频率（图3C上）。其他可能触发MiCai的机械因素方面，液力喷射会在细胞膜上形成凹痕并使膜发生拉伸，用100μmol/L streptomycin或30μmol/L钆（Gd3+）抑制拉伸激活通道，未能消除压力部位下的MiCai起始，表明主要的局部机械传感因子与拉伸激活通道无关。鉴于肌节与骨骼肌间costamere处的许多蛋白质是肌动蛋白结合的机械传感蛋白质，因此用5μmol/L细胞松弛素D处理2h，破坏AMC细胞中的肌动蛋白微丝，使心肌细胞肌膜变硬并阻断收缩，但也没有改变MiCai事件的发生率或Z-groove比率。

图3 向心力衰竭发展时，MiCai传播从局部向整体变化。（A）AMC和MI后16周衰竭细胞的传播时间图。（B）AMC和衰竭细胞中机械诱导的钙瞬变（MiCai）参数。（C）基线以及Caffeine、nifedipine、CCCP和CsA存在下，AMC细胞中的MiCai频率。

04-心力衰竭期间线粒体的重排与触发MiCai相关

       细胞外钙参与的缺乏表明存在细胞内Ca2+源。已知线粒体参与压力诱导的细胞内Ca2+释放，因此采用共聚焦显微镜结合SICM和透射电子显微镜（TEM），研究衰竭细胞中二分体和线粒体之间的相互作用。在正常对照心肌细胞中，活跃的TMRM标记线粒体周期性排列与嵴对齐，反映出Z-grooves和T小管开口排列规则（图4）。心力衰竭细胞中线粒体失去组织规律性，似乎也变长（图4右），碎片变少，线粒体平均面积增加。分别用CCCP和环孢菌素A（CsA）抑制线粒体质子梯度和通透性转换孔，发现消除了衰竭细胞中传播的MiCai（图3C右下）。表明线粒体在该过程中起着积极的作用。因此线粒体紊乱与MiCai传播的发生相关，重塑线粒体微结构域在MiCai起始中可能起积极作用。

图4 MI引发的二元微区重构以线粒体位移为特征。左列：对照AMC；右列：心衰细胞（MI后16周）。从上至下依次为：SICM表面拓扑图像；TMRM标记线粒体；SICM细胞拓扑和表面共聚焦融合图；心衰时线粒体重组的透射电子显微图。

05-微管网络紊乱是线粒体位移的原因

       有研究发现微管参与MiCai和Ca2+i火花产生。用10μmol/L秋水仙素干扰微管聚合（图5）。秋水仙素对表面Z-groove结构（Z-groove指数，处理前0.61±0.04，处理后0.63±0.05）或T小管密度都没有影响。但秋水仙素和诺考达唑处理都使T小管规则性和膜顺应性显著降低。秋水仙素处理后的细胞，液力喷射对嵴施压，会使69%细胞引发MiCai，而对照AMC细胞（没有秋水仙素处理）中，这一比例为12%（图5A）。然而秋水仙素加CCCP（图5C）或秋水仙素加CsA组合处理都能够*消除这种效应。共聚焦和TEM显示对照组中，秋水仙素使肌膜下线粒体发生了位移（图5B右），线粒体平均面积增加，类似心力衰竭细胞。即使在正常细胞中，秋水仙素也会使膜变硬（图5D），并产生与心力衰竭时相似的膜顺应性。表明微管网络的失调使线粒体发生移动，这是MiCai易感的关键机制。

       已知β-tubulin在很大程度上与包括线粒体在内的细胞质细胞器共定位。因此在秋水仙素处理的细胞中研究线粒体移位及其重新定位与微管紊乱之间的关系。免疫细胞化学分析表明，秋水仙素显著破坏了AMC细胞（图5B）和心力衰竭细胞中的心肌细胞β-tubulin。已知心力衰竭细胞中微管蛋白网络异常，qPCR对mRNA表达分析证实了α1A-tubulin（TUBA1A）、β2B-tubulin（TUB2B）、β3-tubulin（TUBB3）、γ-1 tubulin（TUBG1）和tubulin相关蛋白（MAP4）的表达总体增加。以上这些均与微管动力学的改变有关。*破坏衰竭心肌细胞的微管网络（秋水仙素处理）并没有消除MiCai，也不会显著影响膜顺应性。

图5 破坏微管会导致MiCai发生频率更高。（A）MiCai时间进程图。上，20kPa没有产生MiCai；下，10μmol/L秋水仙素36℃孵育1h，20kPa表现出MiCai传播。（B）T小管（绿色）和β-tubulin（红色）染色。最右电子显微镜图片为10μmol/L秋水仙素孵育1h后AMC细胞中染色体移动。（C）不同处理下的MiCai传播频率。（D）秋水仙素和CCCP处理的AMC中嵴和沟处的膜顺应性。

06-人衰竭DCM细胞中的MiCai

       利用扩张型心肌病（DCM）患者的心肌细胞研究人心肌细胞的MiCai发生率。SICM成像揭示了拓扑异质性（图6A），与之前观察到的衰竭大鼠心肌细胞类似。施加压力后65%发生MiCai传播（图6B和6C），主要为压力施加在非横纹、较硬的区域时（图6D），可模拟大鼠心力衰竭模型。与大鼠衰竭细胞类似，人DCM细胞中α1C-tubulin（TUBA1C）、β2A-tubulin（TUBB2A）、TUBB3、TUBG1和MAP4较非衰竭心肌细胞显著上调，表明微管瓦解在细胞MiCai易感中起主要作用（图6E）。

图6 人DCM心肌细胞中MiCai的出现情况。（A）人心衰心肌细胞的膜。（B）MiCai传播时间图。（C）荧光示踪MiCai。（D）人心衰细胞中传播MiCai的频率。（E）与非心衰心肌细胞相比，DCM心肌细胞中微管蛋白mRAN上调。

结论

       本研究结合SICM，描绘了单个细胞中机械引发的脉冲传播，能够以纳米精度识别并定位活细胞（特别是心肌细胞）中的功能性机械感应。得到的数据表明，衰竭会改变肌膜拓扑结构和机械特性，破坏膜结构规律性、使顺应性降低（变硬）。由心力衰竭衍生的心肌细胞中，由于细胞膜硬度较高、微管网络异常，会将局部纳米机械应力产生的局部性、线粒体依赖性的Ca2+释放转变为传播性Ca2+释放，从而启动细胞范围内的Ca2+波传播。另外微管网络破坏是MiCai传播的先决条件，线粒体重排也与触发MiCai有关，而LTCC和肌质网等钙源与MiCai的产生无关。鉴于多细胞水平下的胞内Ca2+波可促进心律失常的发生，本文描述的机制可能解释了部分异位起始和传播引发心律失常的机制。不仅从机械方面加深了理解，也为临床提供了新的治疗靶点。此外，膜顺应性的改变可能成为一个潜在的临床标志，通过改变力的传递从而改变钙含量。

参考文献：

Miragoli,  M. , et al. "Microtubule-Dependent Mitochondria Alignment Regulates  Calcium Release in Response to Nanomechanical Stimulus in Heart  Myocytes." Cell Reports 14.1(2016):140-151.