分子伴侣能够调节人类蛋白质组的质量控制，其中涉及许多疾病，包括心力衰竭。BAG3基因（编码共伴侣蛋白）的突变与遗传性和散发性扩张型心肌病引起的心力衰竭有关。家族性BAG3突变是常染色体显性的，经常导致编码序列的截短，引发杂合子功能丧失机制。然而BAG3基因杂合子敲除鼠并没有表现出可检测的疾病表型。为了在人类系统中建立BAG3心肌病模型，美国研究人员Luke M. Judge等利用人类诱导多能干细胞（iPSCs）产生了一系列BAG3功能缺失突变的心肌细胞（iPS-CMs）。BAG3突变杂合子降低了iPS-CMs的蛋白质表达，破坏了肌原纤维结构，损害了收缩功能。当暴露于已知会引起心脏毒性的蛋白酶体抑制剂时，BAG3缺陷的iPS-CMs对进一步的肌原纤维断裂和收缩功能障碍特别敏感。对内源性BAG3蛋白进行亲和标记和质谱蛋白质组学，进一步确定了人类心脏中BAG3协调的心脏保护伴侣复合物。最后基于这些结果建立了一个模型，用于评估人心肌细胞中的蛋白质质量控制途径及其作为心脏药物毒性的治疗靶点和易感因素的潜力。研究成果以“A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function duringproteotoxic stress”为题发表于JCI insight。

背景

       人的一生中心肌细胞必须保持有恒定的收缩功能，因此细胞会经历连续的机械和氧化应激，而这会引发蛋白质损伤和错误折叠，可能损害收缩功能，并导致有毒肽的形成和聚集。已知心脏几乎没有什么再生能力，因此心肌细胞必须严格地调节新蛋白质合成、降解受损蛋白质成分，以补偿这种蛋白毒性应激。为此，心脏组织保持了高水平的组成型和组织特异xing伴侣蛋白，罕见的伴侣蛋白突变可能会导致严重的疾病。

       蛋白质量控制途径在遗传性和散发性心脏病中扮演重要角色，也是潜在的治疗靶点。辅助伴侣蛋白BAG3是一个值得关注的分子，因为遗传证据表明BAG3变体既youbing理性的，也有保护性的。如罕见的P209L错义突变会导致严重的肌原纤维肌病，这是一种儿童期发病、会影响骨骼肌和心肌的致命疾病，BAG3蛋白可能会增加其功能毒性。此外BAG3有多种杂合突变，其中许多是与功能丧失一致的无义或移码突变，导致常染色体显性家族性扩张型心肌病。BAG3还与获得性心肌病有关，如应激性（Takotsubo）心肌病。而BAG3中的一个常见编码多态性，又与特发性扩张型心肌病发生的显著降低相关，表明该多态性可能具有保护作用。动物模型中，通常利用BAG3突变或缺失制作肌病表型。然而在小鼠中敲除BAG3基因产生的结果不一致：一组呈原发性肌病表型，另一组则是没有明确肌肉表型的全身性病理，但两组中的杂合子缺失小鼠都没有检测到任何表型。由于BAG3相关的人类心脏疾病常常与杂合子功能缺失突变有关，因此小鼠可能无法作为该疾病的理想模型。

       BAG3是由热休克因子1诱导的应激反应基因。虽然BAG3在许多组织中广泛表达，但它在骨骼肌和心肌中表达zuigao，并定位于肌节Z线。作为一种辅助伴侣，BAG3蛋白调节ATP周转以及HS70（组成型）和HSP70（诱导型）的蛋白质折叠活性。它还在物理和功能上与一个单独的伴侣蛋白家族——小热休克蛋白（HSPB）相互作用，并充当连接HSP70与HSPB家族功能的支架。在人类细胞中，BAG 3-HSP70-HSPB复合物通过蛋白酶体和自噬途径调节泛素化蛋白降解。然而实验性研究是通过过表达和/或瞬时敲除手段，在具有不确定生理相关性的永生化细胞系中进行的，鉴于人BAG3突变引起的心脏特异性的病理，以及靶组织中蛋白质的dute表达模式，如果能在心肌细胞中进行疾病建模，将是zuiyou用的。此外为避免因方法产生的虚假相互作用，操纵内源基因为一个优选方法。为评估BAG3在人心肌细胞生理和病理功能中的作用，研究人员还利用基因工程构建的人诱导多能干细胞（iPSCs）产生了一系列同基因的心肌细胞，以更准确地概括人心肌病的各个方面，以及保护心脏免受应激的机制。

结果

01-BAG3突变型iPS-CMs

       在iPSCs的细胞质中检测到BAG3蛋白，在iPSC源的心肌细胞（iPS-CMs）中，BAG3增加了约10倍，并在肌节Z线和细胞核周区富集。首先研究BAG3缺陷对心肌细胞的影响，利用基因工程改造内源性BAG3基因座产生功能缺失突变，以模拟早期无义突变的影响，在BAG3基因的两个不同位点产生了突变（图1）。转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENs）分离出具有功能缺失突变的杂合和纯合克隆，并以第二外显子的两个不同部分为目标，使用以(CRISPR)/Cas9为基础的策略进行了聚类（图1）。测序验证每个工程突变系的基因型。结果证明所有基因修饰的iPSC系都保留了多能性生长和形态、正常核型、表达多能性标记，并能有效地分化为心肌细胞。

       正如预测的那样，BAG3功能缺失突变使BAG3蛋白表达减少（图1）。突变心肌细胞保持分化30天以上，细胞活力、形态或跳动没有明显异常，与出生时心脏形态正常的BAG3基因敲除鼠模型一致。根据人类临床报告和动物研究，假设BAG3突变细胞会随着时间的推移引发肌丝结构断裂，特别是在肌节Z线位置。为检查肌丝结构，将心肌细胞放在玻片上培养并以不同的时间间隔观察，随后固定并染色肌节Z线蛋白α-actin（ACTN 2）。研究发现，心肌细胞放到玻片上会继续跳动，但7天或更长时间后，BAG3-/-心肌细胞的Z线结构发生了严重损坏（图1）。使用5分制评分法对细胞肌节紊乱程度进行评分。与野生（WT）型细胞相比，BAG3突变细胞中肌丝发生显著紊乱的比例增加，BAG3-/-细胞显示出比BAG3+/-细胞更严重的表型趋势。在不同靶向策略产生的品系之间观察结果一致，表明该表型是由BAG3表达而不是靶外效应引起的。

图1 基因组工程构建的BAG3同基因突变使iPS-CMs中肌节混乱。（A）BAG3基因示意图。（B）iPS-CMs中BAG3蛋白的蛋白质印迹。（C）免疫荧光染色和流式细胞术，抗体靶向iPS-CMs中的BAG3。（D）BAG3-/-型iPS-CMs组与WT对照组的病理学比较。（E）5分制评分量化肌节紊乱。

02-生理相关条件下iPS-CMs的收缩功能

       对于在标准组织培养表面上培养的心肌细胞，通常其显示出的形态形状和肌原纤维排列与正常组织中不同。为评估更多生理相关条件下的心肌细胞收缩功能，选择在有特定的几何形状的微图案化表面上，使用不同硬度的聚丙烯酰胺基质培养心肌细胞，通过Plexithermo公司的HCells高通量的单细胞测试平台测量不同机械条件下的收缩功能。将心肌细胞接种到长宽比为7:1的矩形模型上，基质硬度模仿生理性（10 kPa）或病理性增加的（35 kPa）心肌硬度。过测量基质中嵌入的荧光珠的位移来计算单个细胞的收缩力。当在模拟生理硬度的基质上培养时，BAG3+/–和BAG3-/-心肌细胞的收缩力比WT心肌细胞小（图2）。为评估肌原纤维结构并测量肌节缩短，使用LifeAct标记方法，发现与WT心肌细胞相比，BAG3+/–和BAG3 -/-心肌细胞都显示出肌节缩短缺陷（图2）。在模拟病理（35 kPa）基质上的重复实验发现，硬度变大也会导致整体收缩能力减弱以及肌节缩短。因此，BAG3功能的部分丧失损害了人心肌细胞的收缩性能，会肌原纤维结构和活性的破坏，表现出扩张型心肌病表型。

图2 在微图案化基质上培养的iPS-CMs中，BAG3突变产生收缩缺陷。（A）收缩能力是根据测量的力和收缩速度计算的，收缩速度通过显微测定基质中荧光珠的运动产生的牵引力获得。（B）在LifeAct标记的肌原纤维中测量肌节缩短。（C）图案化的LifeAct标记细胞图像和相关的表面牵引应力热图。

03-BAG3防止蛋白酶体抑制剂引发的心脏毒性

       已知BAG3通过蛋白酶体或自噬途径参与靶向的泛素化蛋白降解。因此可以假设，蛋白酶体抑制剂会对BAG3共伴侣活性有缺陷的心肌细胞造成进一步损害。蛋白酶体抑制剂是用于癌症治疗的一类重要化合物，但对动物和人有一定心脏毒性。录像研究发现，蛋白酶体抑制剂bortezomib（bortezomib）和carfilzomib（carfilzomib）处理后，iPS-CMs收缩力呈剂量依赖性降低。而产生这种效应的药物浓度正好在所报道的患者静脉输注后的血浆药物浓度范围内。除去蛋白酶体抑制剂后，收缩力仍继续下降，但几天后恢复（zuigao剂量除外）。值得注意的是，bortezomib对收缩力的作用比carfilzomib更强、更持久。

用同样的方法比较了bortezomib对WT型和BAG3突变型心肌细胞的影响。与WT对照组相比，0.1 μMbortezomib使BAG3突变型iPS-CMs收缩力显著降低（图3）。以相同浓度和持续时间用bortezomib处理生理硬度基质上培养的心肌细胞发现，与WT型相比，BAG3突变型心肌细胞受bortezomib影响更大，收缩力下降更多，并且未能恢复收缩活性（图3）。

图3 BAG3是防止蛋白酶体抑制剂bortezomib引发的严重心脏毒性所需的。（A）自动摄影显微镜系统（Cellogy Pulse），用于连续测量bortezomib（0.1μM）处理前和处理后每24h，iPS-CMs的收缩能力。（B）将在模拟生理硬度（10kPa）基质上培养的WT型和BAG3突变型iPS-CMs暴露于bortezomib（0.1 μM）48h，然后在RPMI/B27培养基中恢复3天测量各个个时间点的收缩力（C，D）用表达荧光融合蛋白ACTN2-mKate2的质粒转染iPS-CMs，标记Z线。通过延时显微镜对单个细胞进行基线成像，在DMSO（0.01%）或bortezomib（0.1 μM）处理后每24h成像。（E）使用5分制系统在每个时间点对单个细胞进行评分。

为确定由bortezomib引起的收缩能力下降是否源于肌丝结构破坏，表达了一种荧光标记的ACTN2来标记活细胞中的Z线。表达转基因的细胞正常存活，并继续正常收缩。延时荧光显微发现bortezomib处理48h内，肌原纤维结构出现缺陷（图3C–E）。5分制评分系统量化中肌原纤维紊乱程度，可见bortezomib处理后，BAG3+/–和BAG3-/-心肌细胞显示出比WT心肌细胞更严重的肌丝结构破坏（图3E）。这些结果支持了BAG3突变体不能补偿蛋白酶体损伤诱导的蛋白毒性应激。

用WT型、BAG3突变型和MYBPC3突变型iPS-CMs进行了剂量反应分析，以检查bortezomib和carfilzomib对收缩性和生存力的影响（图4）。已知心肌疾病中经常会出现心肌肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC3）突变，并可能与BAG3伴侣复合物有相互作用。研究发现，与WT细胞相比，BAG3+/–和BAG3-/-细胞中bortezomib和carfilzomib抑制收缩的EC50显著降低，而MYBPC 3+/–细胞中EC50没有降低（图4）。研究认为这些对收缩性的影响并不单纯是细胞死亡造成的，因为bortezomib仅在BAG3-/-细胞中对细胞活力有显著影响，而carfilzomib在达到抑制收缩性的剂量下对细胞活力的影响非常小。为进一步证实药物毒性的特异性，用心脏毒性hualiao药物ameisu重复了这些试验，没有发现BAG3突变心肌细胞毒性增加的证据（图4）。最后，对于每种药物，WT型细胞中的EC50与患者静脉输注后报告的峰值血浆浓度非常接近，证实该分析在临床相关剂量下是敏感的。

图4 BAG3和蛋白酶体抑制剂之间相互作用的基因和药理学特异性。WT型、BAG3突变型和MyBPC 3突变型iPS-CMs用（A）bortezomib、（B）carfilzomib、（C）ameisu以zhiding剂量处理。在药物处理前和处理后48h测量收缩峰值高度。下图为使用非线性回归分析从每个相应的剂量反应曲线计算的EC50和95%置信区间。

04-BAG3敲除对伴侣蛋白的影响

假设BAG3基因敲除，会对参与协调应激反应的特定BAG3相互作用伴侣的表达有影响。而研究发现敲除BAG3会导致HSPB8蛋白水平降低，但其他伴侣不受影响（图5A-C）。与在永生化细胞系中的发现一致，用bortezomib处理会显著诱导BAG3和HSP70蛋白水平增加（图5A和B）。MG132和carfilzomib也有类似效果。已知在报道的与BAG3相互作用的心脏富集型小热休克蛋白（HSPB5-8）中，只有HSPB6和HSPB8在WT细胞中是由蛋白酶体抑制诱导的（图5A和B）。此外bortezomib处理后，CRYAB（HSPB5）蛋白在BAG3-/-细胞中特异性积累（图5A和C）。

结果表明HSPB8是心肌细胞BAG3功能的一个特别重要的伙伴。有研究报告称，激活自噬降解蛋白毒性肽需要BAG3和HSPB8。因此假设BAG3表达丧失的同时蛋白酶体抑制，将损害心肌细胞调节自噬的能力，而自噬控制泛素化蛋白质的补偿性降解。为测量自噬通量，使用蛋白质印迹法监测巴非霉素A1（抑制自噬降解）对LC3蛋白水平的影响。发现巴非霉素A1处理后，LC3-II快速降解增加了4-6倍，与心肌细胞中活跃的自噬通量一致（图5D和E）。额外使用bortezomib处理使LC3-II水平显著增加，与自噬的补偿性诱导一致（图5D和E）。然而BAG3敲除的杂合或纯合体在任何条件下都不会显著改变LC3-II的水平。此外在WT和BAG3缺陷型心肌细胞中，bortezomib处理后泛素化蛋白的积累是相同的（图5D）。这些发现表明在人心肌细胞蛋白酶体抑制引发的大量自噬通量应答中，BAG3并不是调节该应答所必需的，但并不排除BAG3可能靶向其中的客户蛋白。

图5 bortezomib诱导心脏伴侣应激反应并增加自噬流量，后者不需要BAG3。（A）iPS-CMs用载体对照或1μMbortezomib处理20h，然后提蛋白进行WB。（B和C）条带强度根据GAPDH量化，并根据载体处理对照标准化。B为分别用载体和bortezomib处理的WT心肌细胞，C为分别用载体和bortezomib处理的BAG3-/-心肌细胞。（D）iPS-CMs分别用DMSO、100 nM巴非霉素A1（BafA1）处理6h，或1μMbortezomib处理14h后100 nM巴非霉素A1处理6h。提取总蛋白，抗LC3A/B抗体进行WB。（E）LC3-II带强度根据GAPDH量化，根据对照样品标准化。

05-与BAG3蛋白相互作用的心脏特异性成分

为确定BAG3伴侣复合物的心脏特异性成分和/或客户蛋白，进行了AP-MS。使用基因组工程将一个C末端3×FLAG亲和标签敲入两个等位基因的内源性BAG3位点。当用HSP70进行体外分析以评估核苷酸交换因子活性和客户蛋白释放时，N端和C端BAG3-FLAG与WT BAG3间没有差异。bortezomib处理WT和BAG3-FLAG iPS-CMs，发现暴露48h后收缩力没有差异。AP-MS分析发现，在iPS-CMs中共鉴定出46种与内源性BAG3-FLAG的高置信度相互作用（图6）。伴侣蛋白和相关蛋白质构成了其中zuida的一组相互作用因子，支持了前文假设即BAG3调节心脏中的蛋白质质量控制途径。相互作用网络没有观察到任何与自噬直接相关的蛋白质，与BAG3在调节LC3通量方面缺乏作用一致。从未分化的iPSCs和iPS-CMs中鉴定的相互作用因子中，普遍表达的伴侣蛋白及其相关蛋白大部分重叠。仅从具有内源性BAG3标签的心肌细胞中鉴定出额外的伴侣相关蛋白，包括HSPB8和CRYAB，而心肌细胞中表达的其他小热休克蛋白则不存在，包括HSPB6和HSPB7。此外一些核糖体和其他RNA结合蛋白也被鉴定为心脏特异性的BAG3复合物的一部分，这可能代表了蛋白质质量控制的一个未被充分认识的方面。其余鉴定出的相互作用因子是各种细胞质、肌节、细胞核和分泌蛋白，它们可能是BAG3伴侣复合物的靶标，或者它们暗示了与其他细胞功能的联系。

图6 心脏特异性BAG3蛋白相互作用网络。在具有内源性BAG3-3×FLAG标记的iPS-CMs中，通过AP-MS鉴定出的所有46个相互作用因子按功能类别分组。白色圆圈表示也从未分化的iPSCs中鉴定出的相互作用因子，红色圆圈仅从iPS-CMs中鉴定出的。

结论

本研究建立的细胞模型允许在单个同基因背景下直接比较不同的突变，模拟BAG3功能遗传损失发现杂合BAG3突变导致BAG3蛋白减少约50%，并在人类心肌细胞中产生人类疾病表型。一些试验中BAG3功能部分和*丧失同样损害心肌细胞的生理功能，表明严格调节BAG3表达水平的重要性。蛋白酶体抑制剂bortezomib或carfilzomib处理后，即使BAG3功能部分丧失也会导致收缩功能和肌丝完整性的严重失代偿，证实了BAG3共伴侣功能可防止蛋白毒性应激。

本研究还利用AP-MS鉴定了HSP70和小HSP家族中，与心肌细胞BAG3相互作用的特定蛋白质。证明了内源性表位标签能够帮助在感兴趣的细胞类型的生理表达水平上研究蛋白质相互作用。并通过这种方法鉴定了几种潜在的新型BAG3相互作用蛋白，包括突变会导致包涵体肌病的VCP、常突变于肥厚型和扩张型心肌病中的MYBPC3，其中MYBPC3是weiyi与BAG3复合物结合的肌节蛋白，表明它可能是一种重要的客户蛋白。其他蛋白表明BAG3可能在调节蛋白质组中发挥额外功能，如在核糖体翻译水平上。未来对这些途径的基因和功能研究可能会帮助揭示心力衰竭的机制、药物毒性的遗传易感性，推进新治疗策略的开发。

参考文献：

Luke, et al. "A BAG3 chaperone complex maintains cardiomyocyte function during proteotoxic stress." JCI Insight 2.14(2017).

高通量单细胞功能检测系统

在以上研究中，涉及了一种高通量的单细胞测试平台，它可以对多个hPSC-CMs单细胞进行成像与力学测试。现为大家介绍Plexithermo公司的HCells高通量单细胞功能检测系统(HCells-1基本型，HCells-1F离子测量型）。作为一种非破坏性，非侵入性的细胞检测平台，它可以对多个细胞进行快速成像，同时可得到细胞的收缩力、钙瞬变、收缩速度、细胞大小、面积、实际功率，收缩角度、速度差和力差等大量数据。所搭载的纳米水凝胶的可调控基底硬度，对培养的心肌细胞进行催熟并促进分化以适应不同的研究需求。此外，该平台支持宏观尺度下的功能检测，包括各种组织、斑马鱼模型等，应用前景十分广阔。