Science:组织几何学决定器官培养中乳腺的分支形态发生位点
时间:2022-09-15 阅读:959
包括乳腺在内的许多器官的树状结构是通过分支形态发生(branching morphogenesis)过程形成的。分支形态发生是一个原有上皮细胞发生分支并侵入的重复过程。为探究是什么因素决定着分支形态发生起始的位点,美国劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员Celeste M. Nelson等通过凝胶铸模的方法,使用小鼠乳腺上皮(EpH4)细胞构建了可控制初始几何形态的乳腺上皮小管3D模型,并结合算法对分支情况进行量化,发现小管的几何形态能够决定分支起始的位置。研究进一步证实了分支起始于自分泌型抑制形态发生子,如转化生长因子β(transforming growthfactor–β, TGFβ)局部浓度最小的部位。而组织的几何形态又能够影响局部细胞微环境,从而控制形态发生。该成果以“Tissue GeometryDetermines Sites of Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic Cultures”为题发表于Science杂志。
研究背景
乳腺上皮小管雏形在个体出生时就已存在,但在青春期会突然出现分叉和侧向分支,由此从乳腺上皮小管雏形转变为成年雌性发育*的乳腺导管树。该过程中的分支形态发生受到许多因素的调节,包括生长因子(growth factors)、细胞外基质分子(extracellular matrix)、蛋白酶(proteases)和形态发生子(morphogens)。这些因子必须在发生分支的组织中整合并综合作用,以确定分支起始的位置,确定一组上皮细胞是否要形成分支或分叉。目前在肺、肾和唾液腺等许多器官中针对这一过程的研究,已经有很多技术方法,但关于分支起始的空间位置是如何决定的,目前还无法进行精确的量化分析。考虑到乳腺导管网络是从已有的上皮小管分支出来,研究人员假设上皮小管内细胞的位置可能对起始分支位点有一定的决定作用,并对此进行实验。结果发现组织的形态和环境,包括多细胞小管的几何形状,以及它们与临近小管的接近程度,都能影响分支发生的位置。
结果与讨论
研究人员开发了一种三维(3D)微模型,即将功能正常的小鼠乳腺上皮(EpH4)细胞包埋在特定形状的胶原凝胶空腔中,构建出特定几何形态的乳腺上皮小管,进而通过控制小管的初始几何形态来模拟乳腺雏形,并量化它们发生分支的位置。上述胶原凝胶空腔是使用未聚合的胶原I(collagen I)和弹性“印章”(stamp)铸模产生的(图1A)。包埋于凝胶空腔中的上皮细胞能够贴合空腔大小和形状形成中空小管(图1,B和C)。为量化分支情况并从统计学上表示出大小和位置,研究人员对细胞核进行染色,并将多个荧光图像堆叠以显示出小管内和从小管分支的细胞的平均空间分布(图1D),并将图像图像堆叠制成分布频率图(图1E)。构建的小管模型形成正确极化的双层小管,即由肌上皮细胞和基底膜包围着一层内腔上皮细胞(图1H)。
添加表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)(图1F)小管进行分支形态发生。诱导后24小时内,发现有多细胞分支延伸到周围的胶原基质中,且这些分支只从小管末端开始,并不从侧面开始(图1,F和G)。这一模式与体内乳腺顶芽的二分支类似。
细胞必须发生变形并侵入周围的组织以启动分支发生。已知乳腺和肾脏3D培养过程中,上皮细胞在侵入周围细胞外基质时,分支jianduan会经历短暂的上皮-间质转变(epithelial-tomesenchymaltransition, EMT),该过程会修饰细胞表达的粘附分子,从而使其具有迁移和侵袭性行为。由于凝胶模型系统能够较为确定地(96-99%)预测分支的位置。于是研究人员对迁移相关的波形蛋白基因启动子调控绿色荧光蛋白(GFP)的表达进行实时原位分析,发现在随后会发生分支的位置的细胞中,这种侵袭性间充质表型会被特异性激活(图1,J和K)。同时研究人员发现阻断乳腺分支形态发生侵袭过程所需的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)和间充质来源的形态发生子如表皮形态发生素(epimorphin)的活性,会阻断小管分支,但并不会阻止波形蛋白基因启动子的激活(图S2)。这些数据表明在分支延伸之前,侵袭性表型被限制在一定空间内,细胞根据它们在小管内的位置决定是否进行分支。
图1。构建的乳腺上皮小管的形成的分支的特征。A为构建3D小管模型的示意图。B为诱导分支前小管的相位衬度图像。C为诱导分支前小管细胞actin(绿色)和细胞核(蓝色)染色的共聚焦图像。D为将50张小管细胞核的图像进行堆叠。E为堆叠产生的诱导分支前的细胞分布频率图。F和G分别为加入EGF诱导分支24小时后,小管的相位衬度图和频率图。H为小管中上皮角蛋白-8(绿色)、肌上皮角蛋白-14(红色)和细胞核(蓝色)进行染色,得到的共聚焦图像;插图Z型截面。I为添加EGF24小时后小管的分布频率图。J为添加EGF8小时后,波形蛋白基因启动子-GFP(绿色)和细胞核(蓝色)的荧光图像。K为添加EGF8小时后,波形蛋白基因启动子-GFP的表达频率图。比例尺50μm。
通过检查不同几何形态小管的形态发生过程,研究人员发现增加小管长度会使分支增加,但细胞仍然只从末端进行分支。弯曲的小管优先从曲线的凸面分支(图2A)。分叉小管和树形结构中也观察到不对称分支(图2,B和C),优先从远端位置分支。且分支需要细胞增殖,但并不是于增殖或生长因子受体的局部增强信号而导致分支发生。
有研究发现,分支形态发生的位置可能由邻近间充质组织分泌的刺激性形态发生子有关,可作为上皮分支的化学引诱剂。但远端释放诱导信号如外源添加EGF,又可能被上皮细胞局部释放的抑制信号平衡掉。因此在小管上皮细胞自分泌抑制因子局部浓度最小或阈值浓度以下的位置,就可能是分支发生的位置。
实验中构建的小管内的上皮细胞在没有相邻间充质细胞的情况下表现出模式化行为,因此需要验证这种假设。研究人员整理了各种形态下抑制因子的浓度,发现在稳定状态下每个小管周围都发现了抑制因子形成的浓度梯度(图2,D、E、F),而且在诱导分支的位置,抑制因子的浓度zuidi。
图2。分支位置由小管的几何形态决定,并与分泌型扩散抑制因子的浓度分布相关。A和B 分别为诱导分支24小时后,弯曲小管和分叉小管的分布频率图。C为分形树的actin(红色)和细胞核(绿色)免疫荧光染色图。箭头所示为分支位点。D、E和F分别为弯曲小管、分叉小管和分形树的可扩散抑制因子的浓度分布。实验验证预测的抑制因子局部浓度zuidi的位置就是诱导发生分支的位置。比例尺50μm。
研究人员还探究了增加抑制因子的局部浓度是否足以阻断小管末端的分支。通过减小小管之间的距离(图3,A和B)发现,分支发生在远端的小管末端,相邻近的末端并不分支(图3,C和D)。在约75μm距离内,小管分支都会受到抑制。已知在小鼠乳腺中也发现了类似的导管间距。因此组织的初始几何形态变化也会通过影响抑制因子的浓度分布来改变分支发生的位置。
图3。分支的位置可以通过抑制因子浓度分布来预测。A和B分别为相互垂直和平行方位下,小管周围扩散性抑制因子浓度分布。C和D为诱导分支24小时后的分支频率图,表明高浓度抑制因子的区域,分支受到抑制。比例尺50μm。
已知许多蛋白会抑制体内乳腺分支的形态发生,包括转化生长因子β(TGFβ),它通过I型Ⅱ型受体形成的四聚体复合物发出信号。本研究中构建的小管也能够表达TGFβ及其受体,免疫荧光染色显示TGFβ1的浓度梯度与我们的数值预测相关(图4A)。活性TGFβ1过表达会*抑制分支(图4,B和C)。为确定TGFβ是否在该系统中作为内源性抑制剂,研究人员使用三种方法阻断其信号传导:抗TGFβ1功能阻断抗体处理;用TGFβ Ⅰ型受体激酶活性制剂处理;显性阴性TGFβ Ⅱ型受体过表达。结果发现所有阻断处理都会使整个小管上出现均匀的分支现象(图4,D和E,以及图S6)。
图4。抑制活性部分由自分泌的TGFβ介导。A为小管模型的共聚焦切片,对TGFβ1进行染色,图示沿小管(红色)和远离小管(绿色),相对像素强度和距离的函数。蓝色曲线为预测曲线。B和C分别为诱导分支24小时后,对照小管和过表达TGFβ1小管的分布频率图,证明TGFβ1能够抑制分支。D和E表明阻断内源性TGFβ1信号会扰乱分支的位置控制,分别为载体对照细胞和过表达显性负型TGFβ受体Ⅱ型(HA-DNTβRⅡ)的细胞,对应小管诱导分支24小时后的分布频率图。比例尺50μm。
全文总结
本文用一种简单离体系统,使构建的乳腺上皮小管也能表现出复杂的分支和侧向分支行为,因此在体内,导管的几何形态也会影响形态发生过程。该机制可能帮助我们理解乳腺在发育过程中是如何实现开放结构的。已知分支形态发生的位置至少有一部分是由乳腺和其他分支器官所分泌的抑制性形态发生子如TGFβ的局部浓度决定。考虑到TGFβ以非活性的潜伏形式分泌,且研究发现野生型过量表达的TGFβ1并不会影响分支,因此可能还需要其他信号参与决定分支位置的抑制活性的浓度分布。已知基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)会影响分支。考虑到细胞间的张力可以改变细胞对形态发生子的反应或形态发生子本身的活性,因此发挥作用可能是化学信号也可能是机械信号。
很久以前就有许多理论科学家提出过假设,组织发育模式可能与刺激型和抑制型形态发生子浓度梯度之间的平衡机制有关。本研究使用的凝胶模型系统能够实现直接定量测试这些因素在相关发育环境中的位置整合情况,并可以扩展用于研究控制任何分支器官系统形态发生的机制。
参考文献:
Nelson, Celeste M , VanDuijn, et al. Tissue Geometry Determines Sites of Mammary Branching Morphogenesis in Organotypic CUltures.[J]. Science, 2006.