中国农业研发出4套使用LUYOR-3415和基于CRISPR/Cas系统的核酸检测工具

CRISPR/Cas基因编辑定点突变、修饰、表达调控，已被广泛应用于动物、植物与微生物基础研究与遗传改良。靶向DNA的CRISPR/Cas12和靶向RNA的CRISPR/Cas13被开发成灵敏、的核酸检测工具，以应用于包括病毒等多种RNA、DNA病毒与其它核酸等诊断或检测。已有研究发现，当Cas12/crRNA（CRISPR-RNA）或Cas13/crRNA复合体结合到靶标核酸底物后，既可启动靶向的顺式剪切，还能够引发对其旁侧的ssDNA或ssRNA的非特异性“反式切割”活性，如果在体系内加入由荧光基团/猝灭基团或抗体/标记组成的核酸报告分子，从而释放荧光或标记信号，实现对核酸的定性或定量诊断或检测。对靶标核酸进行偶联等温扩增处理，该系统的检测灵敏度可达到单分子水平。目前，已挖掘出从生黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens XPD3002）CRISPR效应酶Cas13d正向同源蛋白，即RfxCas13d。经鉴定，RfxCas13d在哺乳动物与植物中有很高的靶向RNA基因编辑活性，且该酶体积与分子量比其它酶小30%，具备基因编辑及其衍生工具开发优势。然而，该酶作为核酸检测工具酶的具体参数特征，例如其特异性水平仍没有系统的数据报道。

近日，中国农业作物科学研究所研究团队在鉴定RfxCas13d靶向RNA引发“反式切割”活性基本特征的基础上，研发出基于CRISPR/RfxCas13d检测工具，详细比较了RfxCas13d、LwaCas13a、LbCas12a与AsCas12a活性，建立了多套核酸检测工具，并研发出田间实时可视化灵敏定性定量检测方法。该研究拓展了基于CRISPR原理核酸检测工具的技术能力与应用范围，具有重要的产业应用价值。相关研究结果以“A Field-Deployable Method for Single and Multiplex Detection of DNA or RNA from Pathogens Using Cas12 and Cas13”为题在SCIENCE CHINA Life Sciences 杂志在线发表。

该研究在重组表达与纯化4种CRISPR效应蛋白基础上，首先鉴定了crRNA/RfxCas13d靶向靶标引发的单链寡聚核酸荧光报告分子的碱基偏好性，结果表明RfxCas13d蛋白偏好于切割多聚核苷酸连接的报告分子（PolyrU），而PolyrA、PolyrC与PolyrG切割活性极低，该特征与LwaCas13a类似，但与AsCas12a、LbCas12a倾向于PolyA/T/C明显不同，为Cas13与Cas12蛋白之间开发复合检测工具奠定了可区分性报告分子；分别在向导crRNA分子或靶标RNA上设置系列位置的单、双碱基错配，鉴定其引发切割活性，结果表明该系统特异性达到了可识别单碱基差异水平；为了研究不同体系之间的兼容性，鉴定了6种缓冲溶液体系，鉴定的多酶高活性体系进一步为复合检测方法奠定了反应体系基础；为了增强检测的灵敏性，详细鉴定了靶向底物等温扩增体系及其反应动力学，结果表明偶联等温扩增后检测灵敏度可达到aM量级，反应体系仅有数个拷贝的靶标分子即可引发明显的检测信号。该研究建立了基于RfxCas13d、AsCas12a、LbCas12a与LwaCas13a等4种工具酶高特异性、灵敏性、兼容性的核酸分子检测方法。

为验证该系列技术实际应用，选择了主要农作物生产上的重大病害病原体为检测对象进行了多方面评估。DNA检测验证试验选择了真菌性病害禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）和拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides），这两种致病性真菌是小麦“癌症”--赤霉病的主要病原体，也是玉米穗粒腐和茎腐病罪魁祸首，不仅严重影响产量，还产生毒素影响谷物品质。RNA检测验证选择了水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus ，RBSDV），该RNA病毒可通过灰飞虱（Laodelphax striatellus）在水稻、小麦和玉米宿主之间迁移传播，分别导致水稻黑条矮缩病、小麦矮缩病和玉米粗缩病，威胁粮食作物生产。研究结果表明4个核酸检测系统对包含这些病原体DNA或RNA的田间实际样本粗提物检测灵敏，且可利用LUYOR-3415小型手持式荧光仪或Strip试纸条田间现场定性读取结果，也可以在实验室开展定量分析。此外，以禾谷镰孢与拟轮枝镰孢菌复合侵染为样本，建立了基于Cas12/Cas13联合应用的复合检测，实现一个检测多种病原诊断判读，进一步拓展了检测工具的应用场景与潜力。由于快速基于病原体基因组信息找到特征性的靶标核酸序列，该工具为当前仍无有效诊断技术的病原体检测提供了、低成本的开发途径。此外，该系列检测方法还可应用于食品安全质量检验、动植物检疫、转基因检测、动植物群体的基因分型与基因表达检测，具有重要的应用价值。