2024年3月6日，林木遗传育种全国重点实验室、北京林业大学生物科学与技术学院尹伟伦与夏新莉教授课题组在New Phytologist（中科院一区，影响因子9.4）期刊发表了题为“The miR6445-NAC029 module regulates drought tolerance by regulating the expression of glutathione S-transferase U23 and reactive oxygen species scavenging in Populus”的研究论文，揭示了miR6445-NAC029-GSTU23模块通过调节活性氧稳态在提高杨树抗旱性中的关键作用。

前期研究表明miR6445是杨树特异性miRNA，它可以靶向NAC (NAM、ATAF和CUC) 家族基因，然而，在杨树中，miR6445和NAC基因相互作用的生物学功能尚不清楚。该研究发现了miR6445-NAC029调控模块参与杨树干旱胁迫响应中的作用。miR6445和NAC029都对干旱胁迫都有响应，但表现出不同的表达模式。基于短串联靶模拟物 (STTM) 诱导的基因沉默实验，证明了miR6445对杨树干旱胁迫耐受性有正调控作用。研究人员在杨树中过表达及敲除NAC029，发现NAC029的过表达导致杨树干旱敏感性增加，表现为干旱胁迫下植物萎蔫加剧、膜损伤加剧、脂质过氧化增加、保水能力降低和光合效率降低，活性氧含量增加。Crispr-NAC029则表现出相反的表型（图1）。

图1 NAC029负向调控杨树耐旱性。

通过转录组学测序，作者发现了几种可能受NAC029调控的生物学过程，特别是超氧化物和活性氧代谢过程。进一步研究发现NAC029可以通过直接靶向并抑制GSTU23活性来调节活性氧稳态，从而在干旱胁迫中发挥作用（图2）。此外，GSTU23的过表达显著增强了杨树的抗旱性，表现为干旱胁迫下保持了更好的植株形态，减少了膜损伤，降低了脂质过氧化，改善了光合性能，增强了GST活性，降低了活性氧水平（图2）。这项研究揭示了一个杨树的miR6445-NAC029-GSTU23调控模块，它可以维持活性氧平衡，这对杨树的抗旱性至关重要，这一发现对杨树抗旱性遗传改良提供了新的分子靶点。

图2 miR6445/NAC029在正常条件和干旱胁迫下的功能调控模型。

该研究中，对转基因植物进行深入的分子层面表征是及其关键的。下一代测序（NGS）技术有效弥补了传统Southern杂交和PCR方法的不足，不仅能够快速准确地测定转基因的拷贝数，更能精确揭示其在基因组中的整合。该研究团队通过基因组重测序技术（与蓝景科信合作），以高通量、高分辨率的方式分别鉴定了过表达NAC029、GSTU23株系的基因拷贝数及插入位点。其中，从OE-NAC029-3杨树中获得的跨越宿主基因组与转基因之间连接区域的读取序列，发现与84K WT杨树中有两个位置对齐，一个是第16染色体从2968653到2968659碱基对，有6个碱基对的缺失，为反向插入，插入位点位于Pop-A16G089982和Pop-A16G089983两基因之间；另一个位点是第10染色体从19758803到19758805碱基对，有2个碱基对的缺失，为正向插入，插入位点位于Pop-A10G001190和Pop-A10G001189两基因之间。是一个双拷贝事件。OE-NAC029-4杨树在16号染色体6630336bp处发现了靠近左侧边界（LB）的整合位点,右边界附近的侧翼序列（RB）区域未确定，是一个单拷贝事件，插入位点位于Pop-G16G060808基因内部。同样的，结果显示，OE-GSTU-1杨树转基因被定位在84K杨树的第5条和第16条染色体上，这是一个双拷贝事件。在OE-GSTU-2杨树中，跨越宿主基因组和转基因之间的连接区域的读数被映射到84K杨树的第3条染色体上，这是一个单拷贝事件。

图3 转基因株系拷贝数及插入位点分析。