组份

数目

细胞

 1 T-25瓶

细胞说明书

一份

生长特性：

贴壁生长

细胞来源：

从ATCC/中科院/协和医院等地引进

培养条件：

培养基：F12K+0.1mg/ml肝素+1%ECGS +10%FBS（推荐德国SERANA S-FBS-SA-015优等胎牛血清）

气相：空气95%，二氧化碳5%

温度：37℃

培养：

• 贴壁细胞

1.用75%酒精喷洒整个瓶消毒，将其平躺置于培养箱中进行2-3小时的缓冲，.然后置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5-6mL新鲜培养基并置于细胞培养箱中培yang，依据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液以及传代；

2.待细胞长满瓶底面积80%-90%，需要对其进行传代，次传代比例为1:2。

3传代步骤：将0.25%含EDTA*置于37°预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入1mlPBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1ml预热好的*，置于37°孵育消化（次消化需时常取出置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为*消化时间，记录*消化时间，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之*脱落，然后收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入*培养基重悬细胞，进行传代。

二、悬浮细胞

1.用75%酒精喷洒整个瓶消毒，然后置于无菌操作台，打开瓶口，轻轻吹打后，将其中的细胞悬液转移到离心管中，然后1200rpm离心3min，去上清；

2.将离心好的细胞转移至T-25瓶中，并加入5-6mL新鲜培养基，然后将其置于细胞培养箱中培养，依据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液（离心后去旧液，加入新鲜培养基）；

3.显微镜观察细胞数目比较多时，对其进行传代，次传代比例为1:2（离心后平均分成两瓶培养）。

细胞总数：

1~3*10⁶

传代周期：

2-3天

传代比例：

1:2~1:4

换液频率：

2-3天

冻存液：

90%FBS+10%DMSO

问题

原因

解决方案

细胞生长缓慢

生长培养基使用不当

按照生产商的建议，使用相应的预热生长培养基。

生长培养基中血清质量差

使用其他批次血清。

传代操作不当

按照生产商的建议消化时间及传代比例进行操作。

换液过于频繁

降低换液频率，参考生产商推荐的换液频率。

细胞传代次数过多

使用传代次数较少的健康细胞。

细胞生长超过汇合状态

哺乳动物细胞传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行，建议细胞密度达 80-90%传代。

细胞被支原体污染

将细胞、培养基和试剂丢弃；新取一只冻存细胞，并且使用新的培养基和试剂。

细胞复苏存活率低

细胞冻存不当

新取一只冻存细胞，并储存在液氮中。将细胞储存在液氮中，直至复苏。

自行制备的冻存细胞无活性

将细胞按照生产商推荐的密度冻存。

制备冻存细胞时使用传代次数少的细胞。

严格按照生产商推荐的操作程序冻存细胞。请注意本手册推荐的冷冻程序是冻存细胞的一般流程，只能作为指导原则使用。

新取一只冻存细胞。

细胞复苏方法不当

严格按照生产商推荐的操作程序复苏细胞。请注意本手册推荐的解冻程序是复苏细胞的一般流程，只能作为指导原则使用。

确保冷冻细胞解冻迅速，接种前用预热的生长培养基缓慢稀释细胞。

复苏培养基使用不当

使用生产商推荐的培养基。确保培养基使用前已经预热。

细胞稀释过度

按照生产商的建议，将解冻后的细胞高密度接种，以改善复苏效果。

处理细胞时动作不够轻柔

冻存和复苏过程对大多数细胞都会造成不利影 响。不要通过涡旋振荡或者用力敲打培养瓶的方法使细胞脱落(培养昆虫细胞时除外)，也不要高速离心细胞。

冻存液中所用保护剂在储存过程中未避光

如果未避光储存，冻存保护剂会转变为对细胞有毒性的物质；新取一只冻存保护剂，重新冻存细胞。