TRzol LS（液体样本 RNA 提取试剂）

商品属性：

商品介绍：

保存条件：-20℃保存

产品介绍：
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定 向克隆到线性化的pBM30原核表达载体中。适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。引物T7和T7t可用于菌落PCR和测序 鉴定。 
产品特点：
（2）只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。 （6）载体具有卡那霉和新霉抗性。
（1） 连接反应仅需 5 分钟
（2） 只适合平末端PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
（3） 载体采用了新的制备工艺，零背景，无需蓝白斑筛选。
（4） 具有T7 启动子，类似于 pET30 载体，具备原核表达所需的所有调控元件。适用
于外源基因在大肠杆菌中的高水平表达。
（5） 带 His.tag 和 S.tag 两种纯化标签。
（6） 具有凝血和肠激酶两种蛋白酶酶切识别序列。
（7） 载体具有卡那霉抗性。
注意事项：
（1）引物要求：PCR 引物 5’端不能进行磷酸化修饰，普通商业化引物即可。上游引 物的 5’端添加 CACC 四个碱基。如果表达蛋白需 C 端带 6His 标签，下游引物则需 要去掉基因本身的终止密码子（3 个碱基）。目的蛋白的翻译终止由 6His 标签的终 止密码子TGA 来实现。
（2）DNA 聚合酶：选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。
（3）连接时间：5-15 分钟，通常用 15 分钟。
（4）连接温度：室温 (22℃-30℃)，可使用 PCR 仪控温。最佳反应温度为 25℃。若片段存在高 GC 等复杂结构，可在 37℃反应。

（5）产物要求：为保证 PCR 产物完整，建议 72℃后延伸 5-10 分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的质量和纯度，如 PCR 产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如 PCR 产物为单一条带，无引物二聚体，可取 1-3l 的 PCR 产物直接连接。但若扩增模板为质粒 DNA，应注意质粒的抗性。由于 pBM40 载体为卡那抗性，以氨苄抗性的模板质粒扩增的 PCR 产物直接连接后的产物可涂布在卡那抗性的 LB 平板上。以卡那抗性的模板质粒扩增的 PCR 产物应切胶回收后再连接。
（6） 片段用量：胶回收的 DNA 片段一般使用量为 50-100ng。对照片段为 5’端带CACC四个碱基的全长 EGFP 基因的平末端产物，表达产物大小为 32.6kD。
（7） 往 T7 和 T7t 引物干粉管加 100l 灭菌水即为 5M 浓度的引物。
操作步骤：
1.连接反应
按下表，在一个 0.2ml PCR 管中依次加入

加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管 底。PCR 仪控温 25℃反应 15 分钟，反应结束后， 将离心管置于冰上，等待细菌转化。如暂时不转化， 可冻存于-20℃。

2. 转化
（1）取 5µl 连接产物到 100µl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 20-30 分钟。
（2）42℃水浴中热击 30 秒钟。
（3）立刻置于冰水浴中 2 分钟。
（4）加入 900µl 无菌的不含抗生素的 SOC 或 LB，37℃，200rpm 振荡培养 60 分钟。
（5）4000rpm 离心 1 分钟，去掉部分上清，保留 100µl 用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培养过夜（12-16 小时）。
3. 阳性克隆鉴定：
（1）菌落PCR方法鉴定阳性克隆
A.用10l吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中，吹打混合。
B.在25 l PCR反应体系中加入2μl细菌悬液为模板、5μM浓度的CMVPfor和SV40PolyArev各1μl，PCR方法鉴定阳性克隆。B.在25l PCR反应体系中加入2μl细菌悬液为模板、T7和T7t各1μl，PCR方法鉴定阳性克隆。
C.PCR扩增条件：94℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10 秒钟，55℃退火10秒钟（注：使用基因特异性引物做PCR鉴定时，退火温度则需按其最适温度进行调整），72℃延伸（ 根据片段的大小决定延伸时间，通常每1-2分/1kb），30-35个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近（由于扩增引物在克隆位置的两侧，所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大349bp）可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组体时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。
（2） 限制性酶切分析阳性克隆
pBM30为低拷贝质粒。挑取单菌落接种于8mL含卡那的LB培养液中，过夜培养，小量制备质粒，参考pBM30图谱，选择合适的限制性内切酶（NdeI，Bgl II，Kpn I，NcoI，Xho I），酶切后电泳鉴定重组质粒。
（3） 测序：用T7和T7t对质粒进行测序分析。

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