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标准的PCR三个基本反应步骤

时间:2022-07-18      阅读:2266

类    似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:

1、模板DNA的变性(90℃-95℃):

模板DNA经加热至90~95℃一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备,双链DNA在高温作用下,氢键断裂,形成单链DNA。

2、模板DNA与引物的退火(复性)(60℃-65℃):

模板DNA经加热变性成单链后,温度降至50~60℃,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

3、引物的延伸(70℃-75℃):

DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR全称为聚合酶链式反应,是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。在Taq酶的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′到3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。




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