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　　【仪表网 仪表标准】为贯彻《中华人民共和国环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》《中华人民共和国长江保护法》等法律法规，进一步规范江苏省淡水生物环境DNA监测技术要求，江苏省生态环境厅组织起草了江苏省地方环境保护标准《淡水生物环境DNA监测技术方法(征求意见稿)》，现向有关单位征求意见。
 

　　水生生物监测是以水生生物作为指标，根据生物个体、种群和群落结构对环境污染或变化所产生的反应阐明环境污染状况，从生物学角度为环境质量的监测和评价提供依据。目前国内外常用的水生生物监测类群主要包括长期在水体中生活的底栖动物、浮游植物、浮游动物、鱼、着生生物等。监测方法包括传统形态学鉴定监测和环境DNA监测。
 

　　传统形态学鉴定监测方法通过工具采集到水生生物类群的个体样品，通过观察区分样品中各个体的形态学特征信息，鉴定个体具体为何物种，得知种群的物种组成及密度；环境DNA监测方法采集水样、沉积物、生物膜或生物组织样品， 设计通用引物扩增特定基因片段，借助高通量测序获得DNA 条形码序列，通过数据库比对可以精准地鉴别生物物种和环境中的群落结构信息。相比传统形态学， 环境 DNA 监测方法具有经济高效，流程标准化和精确性高等优势。
 

　　基于分子生物学的环境 DNA(Environmental DNA，eDNA)技术为监测和鉴定水体中物种多样性提供了新型替代手段。环境 DNA 监测技术采集水样、沉 积物、生物膜或生物组织样品，设计通用引物扩增特定基因片段，借助高通量测 序获得 DNA 条形码序列，通过数据库比对可以精准地鉴别生物物种和环境中的群落结构信息。相比传统形态学，该方法具有经济高效，流程标准化和精确性高等优势，极有可能会根本性地改变未来生物监测、生态评估和环境管理的模式。
 

　　本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。参考GB/T 12763.6 海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查；GB 19489 实验室 生物安全通用要求；GB/T 20001.4 标准编写规则 第4部分：试验方法标准；GB/T 29859 生物信息学术语；GB/T 30989 高通量基因测序技术规程；GB/T 34265 Sanger法测序技术指南；GB/T 35537 高通量基因测序结果评价要求；GB/T 37870 个体鉴定的高通量测序方法；GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则；HJ 710.7 生物多样性观测技术导则 内陆水域鱼类；HJ 710.8 生物多样性观测技术导则 淡水底栖大型无脊椎动物；HJ 1216 水质 浮游植物的测定 0.1 ml计数框-显微镜计数法等技术规范编制而成。
 

　　本文件规定了利用环境DNA宏条形码技术监测淡水生物的点位布设、监测频次与时间、试剂和材 料、仪器和设备、监测内容和方法以及质量控制与评价指标。本文件适用于湖泊、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物、浮游动物、着生藻类、大型底栖 无脊椎动物和鱼类等淡水生物监测。其他淡水生物在确定特异性引物的条件下，也可以参照执行。
 

　　监测点位布设：
 

　　环境DNA采样点位设置，参考HJ/T 91，遵循连续性、一致性、代表性和可行性原则。结合环境DNA 的时空分布特征，综合考虑靶向监测类群的生态和生活史、水体类型、水体大小、深度、分层、连通性、 基质、温度、水文和水化学等因素的影响。
 

　　监测频次与时间：
 

　　综合考虑水域环境条件、生物类群的时空分布特点、监测目的及人力、费用投入，确定监测频次和 监测时间。可选择年度(丰水期、平水期、枯水期)、季度(春、夏、秋、冬季)或月度开展监测，避 开雨水集中的时间。
 

　　采样时间需综合考虑靶向监测类群的生态特征和生活史及水体类型。如湖泊、水库需要考虑生物类 群的季节性分层，溪流、河流需考虑迁移物种的分布模式(如鱼类洄游)。
 

　　仪器和设备：
 

　　样品采集及前处理设备要求如下：1.浮游生物网：25 号浮游动物网(孔径 64 µm)；2.竖式采水器：2 L 或 5 L；3.底栖动物采集工具：采泥器、D 形网等；4.水样抽滤设备：具备负 0.9 个大气压以上的的真空抽滤设备；5.标准采样瓶(1000 mL)；6.无菌微孔滤膜(0.22 µm，0.45 µm，1.2 µm 和 5 µm 等)；7.冻存管(无 DNA 和生物残留) 。
 

　　实验室分析设备要求如下：1.低温离心机：离心转速可达 13000 rpm，温控范围低至 4℃；2.微量移液器：0.5-10 µL、20-200 µL 和 100-1000 µL 等；3.超微量紫外分光光度计：测量体积最小 1 µL，波长范围包括 230 nm、260 nm 和 280 nm；4.PCR 仪：温控范围 0-100℃，升温速度 6℃/s，配套 PCR 管 200 µL；5.核酸电泳仪：水平式；6.凝胶成像分析仪；7.高通量测序仪。
 

　　DNA 提取：
 

　　借助物理和化学方法充分释放环境介质中蕴含的 DNA，并去除样品中的蛋白质、脂类、多糖、RNA 等杂质，采用离心柱法和磁珠法等常规分子生物学操作纯化 DNA。