原代培养的实验原理及操作步骤！

原代培养的实验原理及操作步骤！

原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

一、基本介绍

细胞培养是生物学和医学研究的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到次传代阶段，但实际上，通常把代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用*）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

二、分类

的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

⒈组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。

⒉分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如*和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

三、实验

⒈原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用*）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

细胞培养是生物学和医学研究的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的*药物的敏感性来帮助选择效的*方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。

⒉材料和用品

材料：胎鼠或新生鼠

仪器：培养瓶、*瓶、小玻璃漏斗、三角烧瓶、平皿、吸管、试管、移液管、无菌纱布、无菌*、废液缸、血球计数板、蜡盘、科研、大头针、离心管、75%酒精棉球。

药品：培养基(RPMI1640或DMEM)、小牛血清、0.125%*、Hanks液、75%酒精、双抗(*和*)、2%碘酒。

仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、磁力搅拌器、离心机。

附：Hank’s液配方：

KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml

注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

⒊实验步骤

以胚胎小鼠为例

⑴取材：将孕鼠拉颈椎处死，投入75%酒精浸泡数秒消毒，提出孕鼠控掉酒精，放置于蜡盘中用大头针固定。用科研逐层分离皮肤和肌肉组织，打开腹腔。注意不同的解剖层次使用不同的消毒器械。后取出双角子宫置于无菌平皿内。

⑵用Hanks液洗涤3次，剪开子宫取出胚胎。除去子宫、血液和筋膜等组织。

⑶用弯头剪把胚胎尽量剪碎，每个组织块小于1mm3。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用Hanks液洗涤2~3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按两种方法进行，即消化法和组织块培养法。

⑷若使用消化法，则将组织块放人三角烧瓶内加入10~30mL0.125%*，37℃磁力搅拌消化20多min。然后加人少量血清终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，800r/min离心5~10min收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶中培养。

注：细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。

⑸若进行组织块培养，则不做步骤4，加入几滴血清于组织块中，再用弯头吸管将组织块悬液吸起。在一小培养瓶中逐个铺展开，注意将瓶底涂抹均匀。将瓶子翻转倒置后在37℃培养箱内放置2－3h。待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来，从边角加入4~5mL培养基，使细胞接触到培养基，放培养箱内继续进行培养。

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