登革热病毒3型(DFV-III)荧光PCR法【储存条件及有效期】

1．避光-20℃储存，有效期 12 个月。

2．低温运输不能超过 4 天；开封后避光-20℃储存，对有效期没有影响。避免反复冻融，冻融 6 次不影响检测效果。

3．生产日期、有效期至：见外包装盒。

【适用仪器】

适用于 ABI 7500、Bio-Rad CFX96、Roche480 等全自动荧光PCR 检测仪。

【样本要求】

1．样本种类：鼻/咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液；培养物等样品。

2．保存条件：采集的标本应及时送检，24 小时内检测的应 4℃保存，超过 24 小时的最好-70℃保存，并避免反复冻融。

【检测方法】

1 ． 试剂准备（试剂准备区）

将试剂盒各组分置 4℃避光融化，充分混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数 N（N=样本数+1 管阳性对照+1 管阴性对照），根据下表配置反应体系mix，加入一适当体积离心管中，充分混匀后瞬间离心，按 20μL 分装至 PCR 反应管/板，并转移至样本处理区。

【结果分析条件设定】：

u 基线（Baseline）设定：应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域（所有样本荧光信号无较大波动），起始点（Start）应避开荧光采集起始阶段的信号波动，终止点（End）应比最早出现指数扩增的样本Ct值减少1~3个循环，建议基线设为6~15。

u 阈值(Threshold)设定：将阈值线设定在刚好超过正常阴性质控品扩增曲线的最高点。

【质控标准】：

1.   阴性质控品的检测结果应为阴性，无指数扩增期，Ct=40或无Ct；

2.   阳性质控品的检测结果应为阳性，有明显的指数扩增期，Ct值应小于等于35；

3.   以上要求需在一次实验中同时满足，否则该次实验视为无效。

【结果判断】：

1.   阳性：有明显的指数扩增期，且Ct＜38；

2.可疑：有明显的指数扩增期，且38≤Ct<40，此时样本为可疑样本；对于可疑样本建议复核一次，若复核结果Ct<40且有指数扩增期，则判定为阳性，否则判定为阴性；

3.   阴性：无指数扩增期，Ct=40或无Ct值均判定为阴性样本。

【注意事项】：

             1．PCR 操作各阶段应严格分区操作，避免交叉污染。

             2．试剂盒各组分使用前应充分融化混匀，离心数秒后使用。

             3．各组分不得与其他产品或不同批号的相应成分进行互换。

             4．待测标本若不及时检测，应保存于-20℃或-70℃。

             5．样品的处理应该严格按照生物安全规范操作。

             6．PCR 操作人员应具有经验和受过专业培训。

             7．本试剂盒仅用于科研使用，不做为临床诊断使用。

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